小鼠圆头精子细胞注射

圆形精子细胞注射技术可以解决部分非梗阻性无精症患者的生育问题，但其效率非常低。本研究采用小鼠作为模型，探索提高小鼠圆形精子细胞注射后胚胎发育效率的方法。不完全统计显示，全球范围内通过人类圆形精子细胞注射技术诞生的胎儿数量不足200例。

2015年，田中（Tanaka）及其同事报道了通过ROSI技术成功诞生14只胎儿，这一成果成为理解ROSI技术潜力的转折点，重新增强了人们对该技术临床应用可行性的信心。目前ROSI研究的重点集中在表观遗传修饰异常和卵母细胞辅助激活异常方面，而准确识别圆形精子数据也是一项挑战。在本实验室，ROSI胚胎在小鼠中的发育效率已经非常高，与其他实验室的结果相似。

然而，非啮齿类动物（如人类）的发育效率研究仍处于起步阶段。未来，我们将致力于提高非啮齿类动物的发育效率。首先，在下午5:00，向6至8周龄的雌性小鼠腹腔注射7.5国际单位的孕马血清促性腺激素，48小时后再注射等量的人绒毛膜促性腺激素。

注射后确保不与雄性小鼠接触。处死小鼠后，打开其腹腔。用剪刀在靠近卵巢处剪断输卵管，并将其置于预热至37摄氏度的M2缓冲液中。

在正置显微镜的10倍物镜下，找到输卵管透明且膨大的部分。然后使用1毫升注射器固定输卵管，剪下膨大部分，并收集卵母细胞冠丘复合体。为去除颗粒细胞，将卵母细胞复合体置于预热的含0.1%透明质酸酶的M2操作液中，用口控移液器轻轻吹打。

将卵母细胞依次转移到KSOMaa液滴中，清洗三次，然后置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。首先，取一只8至10周龄的C57BL/6雄性小鼠，实施安乐死后打开其腹腔，用剪刀在靠近睾丸处小心剪下附睾。

将含有附睾的培养皿置于直立显微镜的10倍物镜下，并使用1毫升注射器轻轻切碎附睾，使精子流出。用移液管将悬浮液中的精子吸入含有0.5毫升M2缓冲液的离心管底部。

对于圆头精子细胞的分离，将解剖后的睾丸转移至M2缓冲液中。使用1毫升注射器在显微镜下轻轻剪开白膜，然后挤出并切除弯曲的生精小管。提取悬液后，用400目筛网过滤，并对滤过的细胞进行离心。

弃去上清液，加入200微升Hoechst 33342，在37摄氏度下孵育细胞10分钟。将含有染色细胞的流式管放入流式细胞仪中。调节电压后，根据前向散射和侧向散射选择细胞群体。

然后，根据前向散射和触发脉冲宽度去除细胞黏附物。使用355纳米波长激光下的两个检测通道，分选圆形精子细胞并将它们保存在4°C。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞直径约为10微米，中央具有类似突起的核仁结构。

首先，从小鼠中获取卵母细胞和圆形精子细胞。然后，准备适当直径的持卵针和注射针。将卵母细胞放入含有或不含细胞松弛素B的10微升M2液滴中，以软化并保存配子。

然后，将圆形精子细胞的M2液滴放置好，并将操作皿固定在显微操作台上。调整注射位置并固定针头。使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）润湿并清洁注射针。

接下来，将圆形精子细胞吸入注射针中。用固定针旋转卵母细胞，使卵母细胞的极体位于12点钟位置。然后，将注射针小心地置于卵母细胞的3点钟位置。

使用 PiezoXpert 装置在卵母细胞的透明带中打孔。然后将注射针水平轻柔地推进卵母细胞内，并刺破卵母细胞膜。逐渐将圆形精子细胞注入卵母细胞的细胞质中。

拔出注射针，并在开口附近吸取少量卵母细胞膜以封闭开口。进行胞质内精子注射时，将精子置于PVP跑道上。从精子尾部吸入精子，并将其颈部置于注射针口处。

使用压电装置将精子头部与尾部分离。然后，如前所述，用直径为9至10微米的注射针将精子注入卵母细胞。为辅助卵母细胞激活，将卵母细胞置于含有六水合氯化锶的无钙无镁CZB培养基液滴（20微升）中。

然后，将它们转移至KSOMaa培养基中进行培养。同时，建立一组不注射圆形精子细胞或精子的孤雌激活组，用于胚胎学研究。激活后，转移至KSOMaa培养基中进行培养。

与胞质内精子注射的胚胎相比，注射圆形精子细胞的胚胎表现出发育效率降低。