活体小鼠精子顶体钙动力学与胞吐作用的实时成像

我们的研究目标是更深入地理解调控精子功能的分子机制，包括获能和受精等过程。具体而言，我们正在探索膜脂质如何激活钙信号传导以及顶体的可及性。本方案旨在弥补当前在精子获能、精子激活、钙信号传导与顶体外排之间相互作用机制方面的认知空白。

该方案的优势包括能够在生理条件下对精子进行成像，并可同时监测钙信号和顶体外排过程，而无需复杂的预加载或静置步骤。首先，从表达 AcroSensE 的转基因模型小鼠的附睾中收集精子。将附睾置于含有 0.5 毫升 MW 培养基的 3.5 厘米组织培养皿中，在 37 摄氏度条件下孵育 15 分钟，使精子自然游出，完成收集。

然后使用精细镊子，小心地从游出收集皿中去除所有附睾组织。将含有精子的培养基转移至15毫升锥形管中，使用水平转子，在室温下以100 ×g离心1分钟。借助塑料移液管，收集含有精子的上清液，弃去粗大组织碎片形成的沉淀，并将其转移至圆底管中。

加入500微升预热至37摄氏度的MW培养基，将上清液体积调整至1毫升。将此混合液在圆底管中于室温下以400 × g离心8分钟。然后，小心移除上清液，留下松散沉淀的精子。

使用大口径移液管，通过手动轻弹管壁（称为轻弹法）轻轻重悬精子。待精子均匀重悬后，将其转移至新的圆底管中。首先，根据适当的设置，拉制外径为2毫米、内径为1.56毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管。

每次实验前，在填充毛细管之前，使用精细镊子将毛细管尖端打开。加载毛细管时，使用所需刺激物正常浓度的3至5倍浓度的刺激溶液。用一根细塑料移液管缓慢将刺激溶液注入毛细管中，直至填充至其长度的四分之三。

在填充过程中，轻轻弹击毛细管以消除可能形成的气泡。然后将装填好的毛细管安装到显微操作器上。设置单细胞递送系统的参数，以提供5 PSI压力下持续10秒的脉冲。

将安装在显微操作仪上的硼硅酸盐毛细管连接至单细胞递送系统的移液器固定装置。在观察毛细管尖端的同时，施加持续两秒的短暂气流，压力为20 PSI，以确认溶液正从尖端释放。此时，该装置已准备就绪，可用于显微镜下对单个鼠精子进行实时成像。

首先，用多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）或 PDL 包被 35 毫米的盖玻片培养皿。操作时，将 0.5 微升的 PDL 液滴加至盖玻片培养皿的中央。使用 10 微升刻度移液器，将 PDL 液滴均匀涂布于整个盖玻片表面。

将包被好的盖玻片培养皿在 37 摄氏度下干燥 10 分钟。对于成像表达 AcroSensE 的小鼠模型中新鲜采集的精子，将 80 微升预配制的精子悬液加入多聚赖氨酸包被的盖玻片培养皿中央。然后缓慢向培养皿中加入 3 毫升预热至 37 摄氏度的添加物改良 Whitten 基础培养基。

使用显微镜结合单细胞刺激剂递送装置进行成像。首先将含有精子的培养皿安装到显微镜上。然后利用显微操作器，将刺激剂递送系统的毛细管尖端置于目标细胞平面侧方约100微米、上方5至10微米的位置。

将毛细管置于距精子头部100微米以内。接着，在显微镜上启动成像序列。以高帧率对精子细胞进行成像，优选帧率大于每秒10帧。

启动图像采集10秒后，激活单细胞递送系统，给予10秒的刺激剂脉冲。继续采集细胞图像，持续10至15分钟。以类似方式，根据屏幕上显示的位置，对同一培养皿中的多个细胞进行成像。