构建肌腱类组装体以研究疾病与修复中的细胞间串扰

肌腱通过将肌肉产生的力传递至骨骼来促进运动。尽管肌腱损伤很常见，但治疗难度较大，患者的治疗效果往往不理想。目前所有肌腱损伤的治疗方法均包含某种形式的物理治疗，这正反映了机械力在肌腱生物学中具有核心作用。

目前尚无理想的实验模型可用于研究肌腱损伤与修复，因此我们的实验室正在积极开发能够更准确反映肌腱生理及病理生理重要特征的新模型。在先前的研究中，我们已证明肌腱核心（即肌腱的承重部分）自身修复能力极为有限。结合领域内其他研究成果，我们提出假设：受损的肌腱核心会募集来自肌腱外部区域的细胞以协助其修复。

组织工程肌腱模型系统可提供可加载的三维环境，但无法完全模拟体内细胞外基质的复杂结构。组织外植模型系统虽能较好地模拟体内环境，但通常难以长期维持其活性并施加机械负荷，或缺乏修复过程所必需的外部微环境。我们独特的模型系统结合了海洋生物尾腱来源的芯部外植体与基于三维水凝胶系统的优点。

它提供了一种可加载的、类似体内的核心基质，以及一个人工的外部区室。其成分可根据研究假设以及两者之间仿生的跨区室屏障进行调节。我们的杂合水凝胶外植体组装体处于理想状态，可用于研究肌腱核心生物学、基质结构与功能之间的相互作用，以及特定细胞群体在精细可调的微环境中的跨区室相互作用。

通过该系统开展的研究发现将为体内研究和治疗方案的开发提供指导。首先使用80%乙醇对小鼠皮肤进行消毒，并将小鼠转移至无菌生物安全柜中。为分离尾腱核心外植体，使用手术刀在尾部基部进行切割。

然后用镊子夹住尾部尖端，轻轻晃动以撕裂皮肤。缓慢拉离镊子，以暴露肌腱核心外植体。将肌腱核心外植体置于标准培养基中，并使用新的手术刀刀片将其与尾部分离。

接下来，为了分离肌腱成纤维细胞，使用手术刀在小鼠足部中间做一横向切口。从该切口的每一端开始，沿后肢两侧向上至髋部做垂直切口。然后用镊子固定足部的皮瓣，并剥离覆盖在小腿肌肉上的皮肤。

使用新的手术刀片将跟腱与跟骨分离。用镊子固定游离端，并将另一端与腓肠肌分离。将肌腱转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中，并去除残留的肌肉组织。

然后，将肌腱转移至消化液中。接着，使用剪刀在髋关节处剪开，分离后肢与身体。用冷的PBS清洗后肢。

用手术刀去除肌肉，并将其放入置于冰上的培养皿中。在培养皿保持冰上放置的同时，将肌肉组织切碎成小于1立方毫米的小块。将切碎的肌肉组织转移至消化液中。

去除残留的肌肉组织后，用冷的PBS清洗残留的骨骼。将骨骼置于新鲜的冷PBS中，逐步切除骨骺以暴露骨髓。使用一支0.4 × 25毫米的注射针头连接注射器，并吸入10毫升巨噬细胞培养基。

将每根骨骼置于50毫升塑料管上方，从骨骼顶端将针头插入骨髓约1毫米深处。通过排空注射器冲洗出骨髓。首先，准备好夹具支架和金属夹。

将带有金属夹的匹配夹具座放入安装站中，每个夹具座配一个金属夹。将经湿法灭菌的纸片置于金属夹上方。用手术刀沿夹具内侧边界裁剪纸片。

再剪取两片较小的滤纸并保持湿润。用尖头镊子将八个芯状外植体放置在金属夹之间的滤纸上，使其末端位于金属夹上。用较小的滤纸片覆盖芯状外植体的末端，并在上方放置金属夹。

使用螺丝刀和小螺丝将核心外植体固定在金属夹具与夹具支架之间。小心地将夹好的核心植入物转移至硅胶培养室中，并向这些培养室中加入两毫升标准细胞培养基。

然后，使用额外的螺丝固定类组装体。为制备胶原蛋白水凝胶，首先使用细胞脱离溶液将目标细胞从组织培养皿中分离。随后在室温下以400g离心五分钟，并用一毫升标准培养基重悬细胞。

接下来，通过将每份类器官组合体加入 10 微升 PBS、1.28 微升 1 摩尔 NaOH 和 8.72 微升双蒸水来配制交联溶液。加入最多 12 份类器官组合体的细胞悬液，并将试管置于冰上。调整细胞悬液，使其达到以下最终浓度。

另取一管，每份类组装体加入 80 µL I 型胶原蛋白，配制 I 型胶原蛋白溶液，并将试管置于冰上。待所有溶液冰上准备就绪后，吸除含有夹紧核心外植体的培养腔室中的细胞培养基。将 I 型胶原蛋白溶液加入交联溶液中，通过移液快速混匀，避免产生气泡。

将200微升混合溶液加入硅胶培养室的凹槽中，以覆盖各个肌腱核心外植体。在37摄氏度下静置50分钟，使水凝胶聚合。随后，用移液器将1.5毫升相应的共培养基缓慢加入硅胶培养室的角落，小心填满培养室。

将培养室置于大型培养皿或无菌盒中，再放入培养箱。在适当条件下培养类组装体，每周更换两次培养基。用剪刀将类组装体从夹具上取下。

如有需要，可使用镊子将核心组织块从外部水凝胶区域分离。将类组装体在模拟损伤的培养条件下培养超过21天后，观察到核心组织块仍保持机械延展性，外观未发生变化，且在视觉和物理上均可与周围水凝胶清晰区分并分离。此外，周围水凝胶随时间逐渐收缩，收缩程度取决于接种的细胞群体，其中来源于跟腱的成纤维细胞对其周围水凝胶的收缩速度最快。

通过共聚焦显微镜对三维胶原水凝胶中的细胞活力、形态及细胞铺展情况进行评估，结果显示在类器官培养过程中，细胞活力至少维持至第7天。此外，转录组分析显示，核心外植体中Vegfa和Mmps的基因表达显著上调。同样，分泌组分析检测到核心外植体中存在细胞因子，如血管内皮生长因子。