用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

这种微流体生物打印方法的总体目标是生成血管化组织构建体。这种方法可以解决血管化组织生物制造中的关键问题。该技术的主要优点是，它可以在生成三维形状受控的血管槽中通用，用于通过次级细胞接种过程设计血管化组织。

虽然该协议提供了对工程血管化心脏组织的见解，但它也可以应用于许多其他组织类型，例如肝脏、皮肤甚至癌症。不熟悉这种方法的普通人可能会很困难，因为设置生物打印机可能并不简单。要开始此过程，通过将较小的钝针（作为核心）插入较大的钝针的中心（用作护套）来构建双层同心微流体打印头。

确保空芯针从外壳中伸出约 1 毫米。之后，将一根 23 号针头反向插入中心针的枪管中。在外针的针筒侧面打一个孔，并插入匹配尺寸的金属连接器。

用环氧树脂胶密封。使用聚甲基丙烯酸甲酯或 PMMA 支架将挤出机安装到生物打印机的头部。接下来，为了分别通过两根 PVC 管注入生物墨水和交联溶液，将打印头的入口连接到双通道注射泵。

使用藻酸盐、gelMA 和光引发剂的混合物制作生物墨水。溶于含有 10% 胎牛血清或 FBS 的 25 毫摩尔 HEPES 缓冲液中。然后在含有 10% FBS 的 HEPES 缓冲液中制备 0.3 摩尔氯化钙的溶液，用作交联载液。

在生物打印之前，用胰蛋白酶消化人脐静脉内皮细胞或 HUVEC 5 到 10 分钟。将细胞在 15 mL 试管中以 800 RPM 离心 5 分钟。通过缓慢移液 5 到 10 次，以 5 到 10 倍的浓度将细胞重悬于生物墨水中 10 到 6 个细胞/毫升。

接下来，使用双通道注射泵开始通过一个通道注入 HUVECs 生物墨水，并以每分钟 5 微升的流速通过另一个通道注入交联液。允许流持续运行长达 1 分钟，直到它们稳定下来。之后，通过保持每秒约 4 毫米的生物打印机沉积速度来开始打印头移动。

这种生物打印应导致海藻酸盐组分的快速离子凝胶化和超细纤维支架的沉积。打印支架后，将 gelMA 组分与每平方厘米 5 至 10 毫瓦的紫外线光相交联 20 至 30 秒，以完成化学凝胶化。然后用 37 摄氏度的温 PBS 轻轻冲洗，从支架上去除多余的氯化钙。

37 摄氏度的内皮细胞生长培养基中，在 5 体积百分比的 CO2 中培养该支架，最长可保存 16 天。至少每两天更换一次培养基。在培养期间，在显微镜下监测 HUVECs，直到它们迁移到支架微纤维的外围并形成管腔样结构。

然后使用一张无菌滤纸用毛细管力小心地从支架的间隙中取出整个培养基。立即在支架顶部添加一滴次级细胞类型的悬液，例如心肌细胞，让细胞浸润整个组织内空间。之后，将此支架在培养箱中孵育 30 分钟到 2 小时，让细胞粘附在单个超细纤维上。

用 PBS 轻轻洗涤支架，去除非贴壁细胞。在适当的培养基中培养该支架，直到形成所需的血管化组织。此处描述的微流体生物打印允许使用低粘度生物墨水直接生物打印微纤维支架。

尺寸为 6 x 6 x 6 平方毫米<包含 30 多根超细纤维的支架可以在 10 分钟内完成生物打印。支架显微照片的顶视图和侧视图显示了生物打印过程中出色的结构完整性。通过藻酸盐组分与氯化钙的即时离子交联实现。

经过生物墨水的微流控挤出、离子交联和光交联，HUVECs 保持了相对较高的活力。细胞在第 0 天从最初的随机分布增殖并迁移到第 16 天的微纤维外围。接种在支架上的新生大鼠心肌细胞成熟并填充在支架上。

他们表现出功能性心脏生物标志物的强烈表达。如肌节 α 肌动蛋白和连接蛋白 43。填充有心肌细胞的生物打印微纤维支架的共聚焦显微镜检查显示 HUVEC 和心肌细胞共存。

HUVEC 主要存在于微纤维的边界，而心肌细胞则围绕着微纤维的外部。这些细胞能够保持其自发和同步的跳动长达 9 到 28 天。取决于电池来源和支架的配置。

观看此视频后，您应该对如何使用微流体生物打印技术生产血管化组织以及打印头制造和生物打印机作有很好的了解。这种方法的视觉演示至关重要，因为打印头的制造和生物打印机的作对于以前没有使用过的人来说可能很棘手。在尝试此程序时，重要的是要记住使打印头中的两根针同心，并在开始生物打印之前让流量稳定。

随着这项技术的发展，组织工程和生物制造领域的研究人员现在有了另一种使能工具，可以生成血管化组织结构，用于体内再生或体外组织建模。