利用延时显微镜监测肌动蛋白解聚过程
2006年11月8日
好的，今天我想向您展示如何构建一个用于直立显微镜成像的流动腔室，即融合腔室。接下来，我会利用薄膜创建两个空间。具体操作是：取一段Parafilm，将其切成小条状。
接下来，我将进行这一步骤，这基本上会形成通道的壁，我用倾斜的气流将其干燥。将盖玻片放在石蜡上，这是完成后的样品。然后将其放在加热块上加热，使石蜡熔化，从而基本形成密封。
这里所示的是盖玻片，盖玻片上方有两层菲姆膜（phim），如图所示。在此之上，还有一个22毫米×22毫米的盖玻片，就是这个，我将其压紧在灌流腔上以形成密封。
好的，液体从这个方向加入，然后我可以通过这个方向的滤纸将其吸出。稍后我会演示具体操作方法。我喜欢将其放入一个非常简单的加湿孵育盒中。
取两种不同类型的高架条带，并在其下方放置一张滤纸。为了保持环境嘈杂，我将盖玻片盖在流动腔室上。现在，向腔室内引入溶液的方法是：将移液器吸头置于腔室的入口处，然后轻轻排入溶液。
现在，我将密闭培养室孵育10分钟。通常，为了从另一侧吸出液体，我会取一张滤纸并将其剪成这样的细条。然后取其中一条细纸条，在入口处加入溶液的同时，将滤纸条置于出口端，以吸出交换的溶液。
因此，您将看到液体流过溶液。然后，我需要等待五分钟以完成中间封闭步骤。现在，我准备将肌动蛋白（actin）加入，实际上，我需要在流动池内使肌动蛋白聚合，其操作步骤与之前完全相同。
因此，由于是像这样操作，现在反应物已经聚合，我使用大量缓冲液将所有未反应的过量丙烯酸彻底洗去。这里我大约使用了100微升，相当于数倍反应室体积的缓冲液。当滤纸饱和后，就需要更换方向，明白了吗？
现在我已准备好进行成像。将连接有肌动蛋白的灌流腔室置于载玻片上。接下来，我将载玻片安装到显微镜下，由于我将使用油镜进行成像，因此需要在盖玻片的上表面滴加浸油，轻轻接触，以便对腔室内肌动蛋白上的溶液、蛋白质或其他物质进行观察。
因此，我可以在进行延时成像的同时更换溶液环境。
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概述
本文演示了在直立显微镜上用于成像的流室和融合室的构建过程。该过程涉及使用石蜡膜创建通道，并通过加热进行密封。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
背景
- 流动室对于多种成像技术至关重要。
- 构建融合室可增强成像能力。
- 实验室中常用帕拉膜（Parafilm）来形成密封。
- 理解构建过程对于该领域研究人员至关重要。
研究目的
- 提供构建流式腔室的分步指南。
- 演示使用封口膜（parafilm）制作成像腔室的方法。
- 提高成像技术对科研人员的可及性。
使用的方法
- 将 Parafilm 切成条状以形成通道。
- 用倾斜的气流干燥条带。
- 将盖玻片放置在 Parafilm 上方。
- 将组件置于加热块上加热以形成密封。
主要结果
- 成功构建了一个功能性的流式腔室。
- 密封过程有效创造了稳定的成像环境。
- 该方法在实验室应用中具有可重复性。
- 研究人员可将此技术用于多种成像应用。
结论
- 流室和融合室的构建过程简单直接。
- 该方法可促进高级成像研究的开展。
- 此类技术的可及性可提升科研成果水平。
常见问题
行业重要性概述
本方案可实现用于活细胞成像的可控微环境的可重复制备，支持对细胞骨架动态的机制研究。通过标准化流动腔室的组装，该方法降低了基于灌注实验的变异性，提高了不同研究团队间数据的一致性。该技术有助于对肌动蛋白解聚动力学进行定量分析，这一过程在细胞运动性和信号转导中至关重要，与肿瘤学和免疫学中的靶点验证密切相关。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够直接观察肌动蛋白解聚动态，以研究细胞骨架重塑的调控因子。
- 操作价值：为在活细胞中检测化合物对肌动蛋白周转的影响提供了标准化平台。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：支持开发基于荧光的读数方法，用于检测肌动蛋白解聚速率，作为功能性检测的终点指标。
- 操作价值：可在延时成像过程中进行溶液更换，以评估灌流条件下剂量-反应关系。
转化与临床前研究
- 科学价值： 将肌动蛋白动态与转移、侵袭及免疫突触形成相关的细胞表型联系起来。
- 应用价值： 利用可量化的成像生物标志物实现通路抑制剂的临床前评估。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点结合筛选到在与疾病相关的细胞系统中进行功能验证的整个发现流程。
- 发现生物学：通过实时可视化肌动蛋白流动，支持对细胞骨架调控因子的假设验证。
- 筛选：在可控灌注条件下提供定量、可重复的肌动蛋白解聚测量结果。
- 分析：生成时间分辨的荧光强度数据，支持对肌动蛋白周转的动力学建模。
- 转化研究：在细胞迁移的临床前模型中，将分子机制与细胞表型相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的灌注平台，可适配多种细胞骨架靶点和细胞类型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接的功能性读数，对参与肌动蛋白调控的靶点进行机制性去风险化。
- 操作价值：标准化的腔室制备可提高不同实验地点和操作人员间的检测重复性。
- 战略价值：通过将靶点调控与功能性细胞骨架结果关联，实现更早期的立项/终止决策。
- 项目组合影响：基于化合物对细胞迁移和侵袭表型的影响，支持经风险调整后的化合物优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备活细胞成像和微流控流动控制方面的专业知识。
- 依赖于配备环境控制和灌注功能的直立显微镜的使用条件。
- 为确保不同样品室之间的一致性，需对石蜡膜厚度和密封参数进行标准化。
- 针对不同类型细胞的应用，可能需要优化表面包被以及肌动蛋白聚合条件。
- 实际限制包括长时间灌注过程中可能对细胞产生的剪切应力影响，这一点已在实验方案中指出。
