一种基于荧光光谱法快速评估啮齿类和人类脑组织中肌动蛋白聚合状态的检测方法

肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，对细胞形态和生理功能的多个方面起关键调控作用，包括在神经元中。肌动蛋白以两种形式处于动态平衡状态：单体球状的G-actin和多聚丝状的F-actin。肌动蛋白的聚合状态受到多层次的严格调控，既通过肌动蛋白结合蛋白，也通过其自身的翻译后修饰进行调节。

在神经元间的突触连接处，F-肌动蛋白水平的动态变化是关键的调控事件，可控制突触前和突触后终末的信号传导与可塑性。毫不奇怪，肌动蛋白功能障碍与多种神经病理状态相关。近年来的研究进展已极大地增进了我们对肌动蛋白在神经元生理与病理生理过程中作用的认识。

然而，仍有许多未知领域需要重点关注。在这方面，鬼笔环肽的荧光类似物已被证明是肌动蛋白研究中的重要工具。这种毒蕈环肽可特异性结合丝状肌动蛋白，因此可直接用于测定F-actin的含量及其在病理生理状态下的变化。

本研究介绍了一种快速高效的荧光测定法，用于评估离体生物样本中的肌动蛋白聚合状态，例如脑组织的粗制匀浆物以及生化分离的突触末梢。值得注意的是，该方法也可应用于其他细胞和组织类型及其相关的生理现象。有关本研究中所用缓冲液的配方，请参阅详细文本。

使用 Potter-Elvehjem 玻璃匀浆器在冰上将来自大鼠或人类受试者的脑组织样本在 10 倍体积的匀浆缓冲液中进行匀浆。为制备突触体，先以低速离心匀浆液，再以较高速度离心，以获得粗制的突触体线粒体组分。通过不连续蔗糖梯度离心，从该粗制组分中获得富集的突触体。

对于突触体-神经末梢制备物，匀浆依次通过两个100微米和一个5微米滤膜。采用考马斯亮蓝试剂（Bradford reagent）进行蛋白质定量，样品用Krebs缓冲液稀释，终体积为50微升，蛋白浓度为每毫升2至3毫克。对分离的突触末梢（包括突触体或突触体-神经末梢）的刺激，通过在37摄氏度下短暂提高细胞外钾离子浓度30秒来实现。

为此，向样品中加入一摩尔氯化钾，使其终浓度为15毫摩尔。将未受刺激的匀浆和去极化的突触碎片通过加入所需体积的25%戊二醛储备液，用2.5%戊二醛固定。样品在室温下孵育两到三分钟。

通过在20,000 G条件下离心5分钟去除固定剂。随后将样品重悬于含有0.1% Triton X-100和1 mg/mL硼氢化钠的Krebs缓冲液中，在室温下处理2至3分钟以进行透化。再次通过离心去除透化缓冲液，将沉淀物用Krebs缓冲液进行表面洗涤，然后重悬于含有1X Alexa Fluor 647鬼笔环肽（相当于500微单位鬼笔环肽）的Krebs缓冲液中。

在避光条件下，室温孵育10分钟以允许结合反应进行。通过在20,000 G下离心5分钟去除样品中未结合的过量鬼笔环肽，沉淀物用Krebs缓冲液进行表面洗涤，并重新悬浮于含有0.32 mol蔗糖的Krebs缓冲液中，以维持突触体或突触神经体的浮力。将结合了荧光鬼笔环肽的样品加入96孔黑色板中，用于在酶标仪上进行荧光测定。

激发波长和发射波长分别设置为 645 纳米和 670 纳米。每组实验中，我们在含有 0.32 摩尔蔗糖的 Krebs 缓冲液中加入不同量的 Alexa Fluor 647 鬼笔环肽。为校正洗涤步骤中可能发生的样品损失，将样品从黑色 96 孔板转移至透明 96 孔板。

随后在 440 纳米处检测样品的捕获情况。荧光鬼笔环肽的保留量与样品中肌动蛋白纤维或 F-actin 的含量呈直接正比。在 50 至 200 微克蛋白质范围内，观察到鬼笔环肽结合的线性关系。

作为概念验证，我们还测试了本检测方法在F-肌动蛋白去聚合模型中的有效性，该模型通过Latrunculin A对肌动蛋白丝进行药物学破坏，以及通过KCl刺激分离的突触末梢以促进F-肌动蛋白的形成。结合的鬼笔环肽所产生的荧光发射可表示为根据标准线性曲线计算得到的结合鬼笔环肽单位，其数值相对于对照样品。在图4中，F-肌动蛋白水平以结合鬼笔环肽的微单位表示。

另一方面，图5中去极化突触片段内的F-肌动蛋白水平以未去极化的对照样品为参照进行相对表达。我们描述了一种稳健、高效且高通量的检测方法，可用于分析肌动蛋白纤维（即F-actin）及其在生理和病理生理状态下的变化，适用于96孔板格式。该检测方法比现有的其他替代方案更快，可作为肌动蛋白相关研究中的重要工具，既可单独使用，也可与现有的基于免疫组织化学和蛋白质印迹的检测方法联合应用。