利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官 关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究
2024年5月3日
本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。
本研究旨在评估超短自组装肽作为结直肠癌类器官培养基质的应用。我们探讨了类器官形态与存活率、增殖能力、黏附特性以及生物功能化影响相关的问题。目标是优化肽基质的组成，以实现有效的类器官生长，并为再生医学做出贡献。
本领域的前沿技术包括用于精确有机制造的3D生物打印、用于动态培养环境的微流控平台，以及原子力显微镜和多光子显微镜等先进成像工具。CRISPR-Cas9基因编辑技术可实现精准的遗传修饰，而单细胞RNA测序则提供深入的分子层面洞察。当前的实验挑战主要包括提高类器官的可重复性、优化大尺寸结构的血管化，以及模拟复杂的组织架构。
克服长期培养中的这些局限性，并将免疫组分整合到模型中，是当前活跃的研究方向。建立标准化操作流程以及解决伦理问题，仍是该领域持续面临的挑战。本领域的重要发现包括证实超短自组装肽适用于类器官培养。
我们已展示了这些多肽的多功能性、可重复性和稳定性，为微环境的精细调控提供了一个平台。这有助于推动基于类器官的研究、再生医学以及生物功能化水凝胶研究的发展。本实验方案通过提供一种系统性方法来评估超短自组装多肽基质中的类器官，填补了该领域的研究空白。
该方法针对在这些基质中评估细胞行为所需的标准方法，有助于合理设计基于肽的水凝胶以实现类器官的最佳生长，并推动再生医学研究。首先，将20微升（10 µL）的2倍浓度肽溶液滴加到24孔板各孔的中央。孵育后，向每孔加入10微升（10 µL）的2倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。
用移液枪枪头轻轻混合溶液。让凝胶液滴稳定至少20分钟，确保液滴保持完整。接着，将2.5毫升0.0125%胰蛋白酶-EDTA加入含有两百万个SW1222人结直肠腺癌细胞的培养瓶中。
将细胞在37摄氏度下与胰蛋白酶孵育5至10分钟，直至其从培养瓶上脱落。加入5毫升完全培养基以灭活胰蛋白酶。然后使用30微米细胞筛过滤细胞悬液。
使用10微升微量移液器，向每个肽液滴中加入2微升细胞悬液。将SW1222细胞系的800个细胞接种至每个孔中，培养四天。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育液滴30分钟。
然后向每个孔中加入 0.5 毫升的完全培养基。制备对照时，用完全培养基稀释基底膜基质对照储备液。将细胞悬液加入稀释后的基底膜溶液中。
用移液器将20微升稀释的基底膜基质加入含细胞的每个孔中。在37摄氏度下孵育细胞20分钟。待液滴凝固后，加入0.5毫升完全培养基。
在第1天、第4天和第7天使用明场显微镜对细胞进行成像，以评估类器官的生长情况。细胞培养一周后的明场成像显示，小的细胞簇正在组装形成类器官。在多肽水凝胶中培养的SW1222来源类器官呈圆形形态，外观较亮。
颜色较深的外观表明密度过高，这是不理想的，如第七天肽 P 中菌落所见。首先，将 20 µL 肽水凝胶液滴移入 24 孔板中。将 SW1222 细胞系的 800 个细胞接种至每个孔中，培养四天。
第4天，用移液器吸出培养基。用PBS洗涤每个孔两次。然后向孔中加入400微升4%甲醛溶液。
孵育完成后，使用 P-1000 移液器吸头吸除甲醛溶液。随后用 PBS 再洗涤一次孔板。将细胞在 1 毫升破膜缓冲液中于室温孵育 30 分钟。
吸出缓冲液并用 PBS 洗涤孔板后，加入 0.5 毫升封闭缓冲液。随后去除封闭缓冲液，再用 PBS 洗涤孔板。然后向孔板中加入 200 微升稀释后的一抗溶液。
将培养板在4°C下孵育过夜。使用P-200移液枪头吸除溶液，然后用PBS溶液洗涤各孔。
接下来，按1:40的比例将鬼笔环肽偶联物加入已稀释的二抗小管中。用移液器将此混合液加入到板的各孔中。然后在避光条件下于室温孵育三小时。
吸出溶液并用 PBS 洗涤孔板后，每孔加入 300 微升 DAPI 溶液。孵育后，吸出溶液，再次用 PBS 洗涤孔板。将孔板置于 4 摄氏度保存，最长可保存 7 天。
免疫染色显示，在非生物功能化肽P、生物功能化肽P1和Matrigel中发现的类器官均定位于顶膜和基底外侧膜。非生物功能化肽P可诱导基底外侧膜处的细胞间连接表达。首先，使用10倍物镜的落射荧光显微镜对SW1222来源的类器官染色样本进行成像。
仅使用 RHOD 和 DAPI 通道。启动 ImageJ 软件，依次点击 Plugin（插件）、Macros（宏），然后运行来自 CellPose GitHub 网站的 imagej_roi_converter.py 文件。
当窗口出现时，从结肠类器官文件夹中选择第一个文件，然后单击“打开”。接着选择与该文件对应的 seg.npy 文件，然后单击“打开”。
接下来，在 ROI 管理器窗口中点击“全选”，然后点击“测量”。随后在结果窗口中依次点击“文件”→“另存为”，以保存结果。对文件夹中结肠类器官管腔的同一图像重复上述图像转换操作。
然后加载 OriginPro 软件。点击“数据”（Data），接着选择“导入文件”（Import File）以找到导入向导。选择与同一图像对应的类器官和管腔形状特征的两个 CSV 文件。
将管腔形状的属性复制到菌落结果列中，以将每个管腔测量值与其对应的菌落配对。在新列中，将管腔面积除以菌落面积，得到相应菌落的相对管腔面积。选择对应于每个菌落圆形度的列以及管腔面积的列。
然后依次点击“绘图”、“基础2D图”和“散点图”。右键单击绘图窗口，选择“绘图细节”。点击“质心图”选项卡，选中“显示子集的质心点”、“连接至数据点”和“显示椭圆”选项。
在二维培养的细胞中，克隆的圆形度表现出很高的变异性。在Matrigel中培养的细胞，其管腔相对大小的分布更为广泛。
概述
本研究评估了超短自组装肽作为结直肠癌类器官培养基质的应用。研究重点包括类器官的形态、活性、增殖能力以及生物功能化的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 再生医学
背景
- 类器官是模拟器官功能的三维结构。
- 自组装肽可为类器官生长提供支持性基质。
- 目前的挑战包括提高类器官的可重复性和血管化程度。
- 采用3D生物打印和微流控等先进技术。
研究目的
- 优化肽基质成分，以实现类器官的有效生长。
- 研究生物功能化对类器官形态的影响。
- 推动再生医学领域的进步。
使用的方法
- 用于基因表达分析的免疫染色。
- 用于精确有机制造的三维生物打印。
- 用于动态培养环境的微流控平台。
- 先进的成像工具，如原子力显微镜和多光子显微镜。
主要结果
- 评估类器官的形态和黏附情况。
- 深入了解类器官的存活率和增殖能力。
- 鉴定适用于类器官培养的最佳肽类成分组合。
- 有助于理解复杂组织结构的构建机制。
结论
- 自组装肽在类器官培养基质方面展现出良好的应用前景。
- 生物功能化显著影响类器官的生长和形态。
- 仍需进一步研究以解决类器官可重复性方面的挑战。
常见问题
行业重要性概述
采用超短自组装肽基质对结直肠癌类器官进行标准化制备与定量表征，满足了肿瘤学早期发现领域对可重复、可调控的三维模型的关键需求。该平台可系统评估细胞-基质相互作用，提升在疾病相关体系中预测结果的可信度，并促进生物功能性水凝胶的理性设计。该方法增强了从发现生物学向临床前模型开发的转化连续性，直接影响项目筛选与机制层面的风险降低。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在可控且可调节的基质环境中研究细胞黏附和管腔形成。
- 通过量化类器官形态及细胞-基质相互作用，支持靶点功能验证。
- 通过生物功能化基质与非生物功能化基质的比较分析，促进作用机制的降风险研究。
- 为基于假设的细胞外基质信号研究提供可重复的实验平台。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化的类器官接种、培养和成像方案，支持实验的可重复性。
- 生成定量输出结果（如圆形度、管腔面积），用于可靠的表型筛选。
- 实现经验证的三维生物系统的制备，用于后续化合物评估。
- 通过明确定义的水凝胶成分和成像工作流程，支持平台的可扩展性和重复使用。
转化与临床前研究
- 采用合成基质中的结直肠腺癌细胞系，与疾病相关建模相一致。
- 从发现阶段的基质优化延续至临床前类器官验证，提供连续性。
- 基于定量、可重复的类器官指标，支持进行风险调整后的推进决策。
- 通过免疫染色和荧光图像分析，支持转化生物标志物的开发。
流程与工作流整合
该方法通过实现标准化的三维类器官制备、定量成像以及数据驱动的基质优化，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：支持对细胞-基质相互作用及类器官结构的假设验证。
- Screening：在不同基质条件下提供可重复、定量的表型比较读数。
- Analytics：提供统计学输出结果（例如，圆形度、相对管腔面积），用于条件比较与决策支持。
- Translational Research：连接合成基质开发与疾病相关的类器官建模。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的实验方案，用于多种肽水凝胶及类器官系统的评估。
运营与企业影响
- 科学价值：提高三维癌症模型的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化类器官培养与分析中的工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于信息的决策制定，实现资本高效化的基质优化。
- 项目组合影响：支持根据风险调整，优先推进特定基质组分和类器官模型的开发。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养、免疫染色和定量图像分析方面的专业知识。
- 需要具备荧光显微镜及兼容的图像分析软件（例如 ImageJ、OriginPro）的使用条件。
- 要求不同研究团队在水凝胶制备和成像方案方面实现标准化。
- 针对不同细胞系或疾病模型可能需要进行方法优化。
- 长期培养以及免疫组分的整合仍是当前面临的技术挑战。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:39
SW1222 Cell Line‐Derived Colorectal Cancer Organoid Fabrication in Ultrashort Self‐Assembling Peptide Matrix
5:24
Immunostaining of Colorectal Cancer‐Derived Organoids in Peptide Hydrogel
7:59
Imaging Immunostained Colorectal Cancer‐Derived Organoids in Peptide Hydrogel for Evaluating the Effects of Self‐Assembling Peptides on Cell Adhesion
