Ex Vivo Culture of Circulating Tumor Cells in the Cerebral Spinal Fluid from Melanoma Patients to Study Melanoma-Associated Leptomeningeal Disease

黑色素瘤所致的软脑膜疾病（M-LMD）是一种侵袭性的脑膜转移形式，循环肿瘤细胞（CTCs）会侵入脑脊液。遗憾的是，目前尚无针对 M-LMD 的有效治疗方法，因此了解其生物学特性将有助于开发疗法以降低死亡率。近期的研究报道了 CTCs 如何在营养匮乏的脑脊液环境中定植，例如利用铁摄取能力增强其存活，并通过补体 C3 促进经脉络丛侵入脑脊液。

因此，CTC 是研究 M-LMD 的极佳工具。研究脑脊液 CTC 所面临的最大挑战在于缺乏临床前模型以及这些细胞的稀有性。探索从患者体内培养这些稀有且脆弱的细胞并建立异种移植模型的方法，将极大有助于研究人员深入理解 M-LMD 的病理机制，并设计出合理的治疗方案。

我们已建立一种方法，成功在体外和体内扩增了来自黑色素瘤软脑膜转移（M-LMD）患者的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF CTCs），使我们能够对M-LMD细胞进行分子和功能分析，并在异种移植模型中开展疗效研究。尽管当前的方法尚不完善，但首次实现黑色素瘤患者脑脊液CTCs的培养与扩增，使我们深入认识到理解脑脊液微环境的重要性。开始实验前，需用多聚-L-赖氨酸预包被T175培养瓶。

将烧瓶置于37摄氏度的培养箱中孵育一小时。然后使用无菌刻度移液管吸除赖氨酸溶液。用移液管向烧瓶中加入30毫升含有人脑膜细胞的完全脑膜培养基。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞融合度达到约75%至80%时，收集人脑膜细胞（HMC）培养基，并保存于50毫升锥形管中。随后按1:1比例向管中加入完全脑膜培养基。

最后，用移液器将生长因子加入试管中，以制备HMC条件培养基。处理脑脊液时，首先将其置于冰上预冷的15毫升锥形管中进行冷却。然后在预冷的离心机中以257 × g在4°C下离心5分钟。

用移液器小心吸出上清液，避免扰动细胞沉淀，并将上清液分装至不同的离心管中。向细胞沉淀中加入1 mL PBS以重悬细胞。在4 °C条件下，以1,500 × g离心5分钟。

吸弃 PBS 上清液，保留约 50 微升于管底。在培养细胞前，对细胞悬液进行细胞计数。在人脑膜细胞培养的培养基中，多种生长因子表达上调。

首先，在4°C条件下，以257 × g离心力离心冻存的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF CTCs）解冻后的培养物5分钟。用移液器吸除上清液。加入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀，再次吸除上清液。

接下来，将细胞重悬于3个独立的96孔板孔中的450微升HMC条件培养基中。将150微升细胞悬液分别移入96孔板的另外3个不同孔中。每隔三天用新鲜培养基补充HMC条件培养基。

当细胞培养达到90%融合度时，将消化后的细胞从一个孔转移至24孔板中的空孔内。在肿瘤细胞的持续培养过程中，筛选出发生转化并呈指数扩增的细胞克隆用于后续实验。首先，鉴定患有软脑膜病（leptomeningeal disease, LMD）的雌性免疫缺陷型NSG小鼠。

将麻醉后的小鼠置于手术台上。将小鼠的鼻部放入立体定位仪的改良L型鼻锥中，确保鼻孔通畅无阻。轻轻牵拉双侧耳廓腹面的皮肤向前。

然后用胶带将其固定在鼻锥上。将手术剪刀尖端从耳廓向下沿着枕骨引导。在可触及的凹陷处上方正中线位置做一个5至7毫米的小切口。

使用一对尖端为1至2毫米的钝头镊子，轻轻按压小脑延髓池。将镊子尖端闭合后插入，同时向下按压硬脑膜并逐渐张开。继续进行钝性分离，直至清晰可见硬脑膜及其暴露区域内的相关血管。

保持镊子张开以牵拉周围肌肉组织。然后将27至29号针头连接到1毫升注射器上。将注射器插入硬脑膜下方，以观察针尖斜面。

缓慢回抽注射器活塞，尽可能多地收集脑脊液。立即将液体转移至微量离心管中，并置于冰上。

在4°C条件下，以257 × g离心样品5分钟。吸除上清液后，向细胞沉淀中加入500微升无菌PBS。在室温下，以257 × g再次离心沉淀5分钟。

弃去上清液，然后将沉淀转移至含有HMC条件培养基的96孔板中。