胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像
2024年3月8日
在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。
在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于脑室区，并向大脑表面迁移。许多基因参与了这一过程，其中包括与神经发育障碍和精神疾病相关的基因。我们正在研究这些基因在该过程中对细胞行为的功能作用。
近期，我们报道了星形胶质细胞前体细胞表现出两种不同的迁移模式，即随机迁移和血管导向迁移。这些观察结果是通过本视频中介绍的血清型特异性标记与延时成像观察方法相结合而获得的。在细胞标记过程中，我们采用了子宫内电穿孔系统，该系统由我们开发，可用于以高信噪比对单个细胞进行可视化。
通过共电穿孔导入目的基因的表达载体或敲低载体，该体内基因转移系统还可使我们能够便捷地对特定基因进行功能获得或功能缺失实验。利用此实验系统，我们的目标是观察神经元、胶质细胞和血管的细胞行为，并阐明它们之间的相互作用。这些研究结果将有助于理解神经发育障碍的发病机制。
首先，将麻醉后的小鼠置于38摄氏度的加热板上。沿中线做皮肤切口后，在皮肤上放置无菌塑料膜，再覆盖一张无菌滤纸，并在中央打孔。用无菌PBS润湿滤纸，然后小心地将子宫角通过小孔缓缓拉出。
使用连接至吸液管组件的微量移液器，将一微升质粒混合物注射到左侧或右侧脑室。通过子宫壁施加呼气压力。用镊子型电极夹住胚胎头部，并使用电穿孔仪传递电脉冲。
将子宫角放回腹腔后，使用5-0丝线缝合腹壁和皮肤。首先，取已注射适当质粒并实施安乐死的小鼠。在培养皿准备过程中，向玻璃底培养皿中加入1.9毫升培养基，并小心地将细胞培养插件放置其上。
然后向滤膜上加入 500 µL 培养基，并将滤膜置于冰上。取出胚胎并放入含有预冷 PBS 的培养皿中。在显微镜下，根据绿色荧光蛋白或其他荧光标记的表达情况筛选胚胎。
解剖脑组织后，将其放入盛有熔融琼脂糖凝胶的冷冻模具中，并滚动数次。待琼脂糖在室温下完全凝固后，置于冰上。使用振动切片机将脑组织进行冠状面切片，厚度为350微米，并将切片整齐排列在滤膜上。
然后从滤杯内部和外部各移除 600 微升培养基。五分钟后，在细胞培养插件内部加入 100 微升新鲜培养基。对于延时成像，使用长工作距离 20 倍物镜采集约 10 组 Z 轴层扫图像。
对小鼠脑部延时成像的分析提供了 EGFP 阳性迁移细胞和 RFP 阳性迁移细胞从 2 到 21 小时的迁移轨迹。
概述
本研究聚焦于大脑皮层的发育过程，重点阐述神经元和胶质前体细胞从脑室区向脑表面迁移的现象。通过结合活体延时成像技术与子宫内电穿孔法进行细胞标记，该研究探讨了星形胶质细胞前体的迁移模式以及影响神经发育和精神疾病相关基因的功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经发育
- 细胞迁移
- 神经生物学
背景
- 该研究探讨了皮层发育过程中神经元和胶质细胞的起源。
- 研究涉及特定基因在神经发育和精神障碍中的作用。
- 星形胶质细胞前体表现出与皮层形成相关的独特迁移模式。
- 体内基因转移技术有助于观察这些迁移模式。
研究目的
- 观察和分析迁移神经元与胶质细胞的行为。
- 阐明参与神经发育的基因的功能作用。
- 研究神经元、胶质细胞和血管之间的细胞行为及其相互作用。
使用的方法
- 采用子宫内电穿孔技术进行基因转移和细胞标记。
- 利用小鼠模型研究神经元和胶质前体细胞的迁移。
- 涉及对EGFP和RFP阳性细胞进行延时成像。
- 该方案概述了用于精确观察的特定手术和成像技术。
- 包括使用振动切片机制备脑组织切片以进行分析。
主要结果
- 确定了两种不同的星形胶质细胞前体迁移模式：随机迁移和血管引导迁移。
- 展示的数据表明迁移细胞在时间进程中的明确轨迹。
- 研究结果有助于理解神经发育障碍的机制。
- 证明了电穿孔技术在可视化单个细胞方面的有效性。
结论
- 本研究揭示了皮层发育过程中神经元迁移的机制。
- 研究结果可能增进我们对神经发育障碍和精神疾病的理解。
- 研究结果强调了胶质成分与血管成分在脑发育过程中的复杂相互作用。
常见问题
行业重要性概要
对胚胎小鼠脑切片中迁移的神经元和胶质前体细胞进行延时成像，可直接观察神经发育过程中细胞动态变化。该技术对于降低靶点验证风险、理解疾病相关体系中基因功能至关重要，尤其适用于神经发育障碍和精神疾病的研究领域。通过将基因扰动与可量化的细胞行为关联起来，该方法有助于在早期发现阶段建立可靠的预测信心。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可对与神经发育障碍相关的候选基因进行功能学研究。
- 通过揭示基因修饰如何影响神经元和胶质细胞迁移，支持机制层面的风险评估。
- 通过直接观察细胞表型，实现高可信度的靶点验证。
- 在生理相关背景下，为基因功能获得和功能缺失研究提供平台。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的脑切片系统，用于细胞迁移动态的定量分析。
- 提供可重复的高信噪比成像结果，适用于下游筛选工作流程。
- 支持迁移实验的标准化，便于对遗传或药物干预进行比较评估。
- 支持多重分析多个基因扰动的可扩展性。
转化与临床前研究
- 通过重现体内神经发育过程，与疾病相关模型相一致。
- 从基因发现到机制假说的临床前验证，提供转化研究的连续性。
- 基于与疾病基因相关的定量迁移表型，支持风险调整后的研发推进决策。
- 通过动态细胞读数支持生物标志物的鉴定。
流程与工作流整合
该方法可融入从早期基因功能研究到临床前模型验证的整个发现过程，架起靶点识别与机制去风险化之间的桥梁。
- Discovery Biology：支持在神经元和胶质细胞迁移中进行基因功能的假设验证。
- Screening：为检测方法开发提供定量、可重复的迁移指标。
- Analytics：可测量迁移速度、轨迹和模式，用于比较分析。
- Translational Research：在临床前模型中将基因扰动与疾病相关的细胞行为关联起来。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用的成像与分析平台，适用于多种神经发育相关基因靶点。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证和机制理解的预测可信度。
- 操作价值：提供标准化、可扩展的成像工作流程，适用于跨项目应用。
- 战略价值：通过将基因扰动与细胞功能结果关联，改善决策进程中的立项或终止判断。
- 项目组合影响：实现对神经发育障碍靶点的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备胚胎脑解剖、子宫内电穿孔以及高级成像技术方面的专业知识。
- 需要具备高分辨率荧光显微镜和延时成像设备的使用条件。
- 需要建立标准化操作流程，以确保不同团队和项目之间的可重复性。
- 针对不同的遗传载体或模型系统，可能需要进行方法优化与调整。
- 潜在局限性包括活体组织成像本身所固有的技术复杂性和通量限制。
