利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

以下实验的总体目标是利用小分子诱导，直接且专一地从多能性人类胚胎干细胞中获得神经元后代。该过程通过在特定条件下维持未分化细胞，并添加视黄酸来实现。随后，通过将细胞从培养物中解离并转入悬浮培养，继续诱导其分化，形成称为神经母细胞的漂浮细胞簇。

如果允许神经母细胞在神经分化培养基中贴附于组织培养板，则它们会发育出成熟神经元的特征。最终，可通过免疫荧光结合去卷积显微镜或共聚焦显微镜，观察视黄酸处理对人胚胎干细胞形态及标志物表达的影响。在其他技术中，仅有少量细胞会向神经元表型分化，而我们的方法通过添加小分子，即可实现对多能人胚胎干细胞向神经元谱系的高效、可控且特异的诱导。

在配制储存液时需注意几个步骤。Matrigel 和人源层粘连蛋白需从零下 80 摄氏度缓慢解冻至 4 摄氏度，并在 4 摄氏度下避光保存培养基；使用前务必将其预热至 37 摄氏度。此外，在配制人源 ESL 培养基时，部分添加剂需在使用前即时加入。

这些成分包括bFGF、抗坏血酸、具有A活性的人胰岛素以及转铁蛋白。接下来，在包被培养板之前立即配制Matrigel或人层粘连蛋白工作液。在明胶预包被的组织培养板制备完成后，将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。

明胶可用Matrigel或层粘连蛋白工作液替代。将这些培养板在4°C下孵育过夜以完成包被。首先让人胚胎干细胞集落生长5至7天，然后准备进行传代。

挑选含有超过75%未分化人胚胎干细胞的克隆；这类克隆通常略呈半透明，边缘清晰，细胞堆积成簇。开始分化的迹象通常表现为含有大部分已分化细胞的白色克隆，外观透明。请勿挑选白色或透明的克隆。

将培养皿置于光线下观察，用记号笔在培养皿底部沿菌落轮廓描出略显不透明的菌落。使用无菌P2移液器吸头的边缘，将人胚胎干细胞菌落周围的成纤维细胞层剥离。随后去除周围的成纤维细胞，并清除菌落中所有已分化的部分。

现在吸除含有已脱落分化细胞的旧培养基。接下来，用不含BFGF的人类胚胎干细胞培养基洗涤未分化细胞，每孔洗涤一次，然后立即在新鲜培养基中加入三毫升含B-F-G-F的新鲜人类ESL培养基。现在使用无菌的P2移液枪吸头将细胞集落切割成小块，并从培养板上分离下来。

将分离的菌落碎片连同培养基吸入一个50毫升的锥形管中。每个孔额外再吸入1毫升培养基进行冲洗。

细胞现已准备好，可使用小分子进行进一步分化。首先将新包被的培养板预热至37摄氏度。从培养板中吸除包被液，然后向每孔加入含细胞集落片段的4毫升培养基，轻柔地将培养板转移至培养箱中，避免振荡。

不要扰动培养板，以允许细胞贴壁。贴壁培养三天后，制备含有omic酸的新培养基。然后吸除大部分旧培养基，仅留下足以保持细胞浸没的培养基量。

切勿让细胞干燥。每孔加入四毫升含BFGF和视黄酸的新鲜人胚胎干细胞培养基。每隔一天更换一次培养基，使经视黄酸处理的人胚胎干细胞集落继续生长。

经过七到八天后，细胞将发生形态学变化，转变为大型分化细胞。随后开始制备悬浮细胞培养物：首先将已自发分化并迁移形成成纤维细胞层的 ESL 克隆从细胞中分离。使用前述方法配合无菌移液器吸头操作，然后吸除含有游离脱落的成纤维细胞的旧培养基。

用 HESC 培养基洗涤细胞一次，并将细胞重悬于 3 毫升 HESC 培养基中。现在使用无菌的 P2 移液枪头，将细胞集落切割成小块，并从培养皿上分离下来。

将含有脱落菌落的培养基转移至一个50毫升的锥形管中。用1毫升培养基冲洗孔板孔壁，并将冲洗液加入收集液中。随后，将混合细胞悬液每4毫升分装至6孔超低吸附板的每个孔中，培养4到5天，并将板置于培养箱中。

在此期间，将形成漂浮的细胞簇或神经母细胞，以进一步促进神经母细胞向更成熟的神经元表型发育。将含有细胞的培养基转移至50毫升锥形管中，随后以1,400 RPM离心5分钟。

吸出旧培养基，尽可能称取其重量，并加入等量含VEGF N NT three和BDNF的新鲜NSC培养基。用移液器吹打使细胞重悬，然后每孔加入4毫升细胞悬液至6孔组织培养板中，将培养板置于37°C恒温湿润培养箱中。

神经母细胞将附着于培养板过夜，以便在Matrigel或人源层粘连蛋白上进行神经母细胞悬液的3D培养。3D基质将在37摄氏度下聚合。每隔一天更换一次培养基。

两周内，将出现大量具有神经突的神经元细胞和色素细胞网络。视黄酸足以诱导在特定培养体系中维持的人胚胎干细胞从多能性完全转变为神经外胚层表型。当未分化的人胚胎干细胞暴露于视黄酸后，集落中的所有细胞均发生形态学变化，转变为较大的分化细胞，并停止表达多能性相关标志物OCT4。这些细胞还开始表达多种神经外胚层相关标志物，如HNK-1、P2和TRKC。

这些大型分化细胞持续增殖，细胞集落自发增大，并表达早期神经元标志物 beta three tubulin。在细胞堆积区域的集落中，开始出现更为成熟的神经元标志物 map two。与此同时，随着神经外胚层细胞的出现，与多巴胺能神经元分化及酪氨酸羟化酶基因激活相关的神经元特异性转录因子 NER one 转位进入细胞核。

解离后，视黄酸处理的人胚胎干细胞在撤除基础成纤维细胞生长因子（bFGF）并置于悬浮培养时形成神经母细胞；当允许这些神经母细胞贴附于组织培养板上后，开始出现大量带有神经突起的神经元细胞网络以及色素细胞，这些特征典型地代表中枢神经系统（CNS），且分化效率显著提高，可连续培养超过三个月。与未经视黄酸处理而自发进行多谱系分化的细胞相比，这些人胚胎干细胞来源的神经元细胞表达βIII微管蛋白，并且共表达MAP2。一旦掌握该技术，可在约四周内从多能性人胚胎干细胞中稳定、均一地诱导生成神经前体细胞及神经元细胞。

请注意，操作人类细胞可能具有极高危险性，因此在进行本实验前，必须采取相应预防措施，例如确保细胞系无病原体和支原体污染。