体外共培养系统重现癌症-免疫循环

本方案可对癌症免疫循环的每一步进行简单、快速且可靠的监测与表征，从而有助于识别维持癌症免疫监视与免疫逃逸之间平衡的关键机制。肿瘤微环境中癌细胞与免疫细胞之间的相互作用及其共进化，已被认为是决定治疗效果的关键因素。目前，多种技术正在推动本领域的研究进展，包括流式细胞术、单细胞转录组学、空间转录组学、蛋白质组学、芯片上肿瘤模型以及体内模型。

本方案相较于其他技术具有显著优势，可提供一种简单、快速、可靠且低成本的方法，用于监测和表征癌症免疫循环的每一步骤。未来，我们希望研究免疫原性治疗和免疫治疗条件下肿瘤微环境的动态变化。首先，在100毫米的培养皿中，将3×10⁶个MCA 205纤维肉瘤细胞接种于10毫升完全生长培养基中。

用紫外线照射细胞，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少6小时，以诱导细胞死亡。将体外分化的树突状细胞（DCs）用完全生长培养基在1,100 G条件下离心4分钟，洗涤两次。使用台盼蓝染色排除法计数骨髓来源的MDDCs。

将辐照后的癌细胞在1,100 G条件下离心5分钟。以2:1的比例在12孔板中设置MDDC与辐照后凋亡细胞的共培养体系，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，在15毫升离心管中用10毫升完全培养基以1,100 G离心5分钟，洗涤细胞两次。

进行细胞表面染色时，将骨髓来源的树突状细胞重悬于20 µL预冷的FACS缓冲液中，在4°C避光孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞后，加入100 µL含活力可固定近红外染料的PBS，孵育30分钟。用PBS洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于FACS缓冲液中。

根据前向散射（FSCA）和侧向散射（SSCA）特性识别目标细胞。随后，绘制FSCA与前向散射高度（FSCH）以排除细胞双联体和细胞团块。绘制780至60纳米发射带通滤光片面积与SSCA以去除死细胞。

使用575至26纳米和530至30纳米的发射带通滤光片，在双参数密度图中检测细胞对CD11c标记物和PKH67荧光细胞连接剂的阳性率。计数后，将CD8 T细胞与摄取凋亡MCA 205细胞的骨髓来源树突状细胞以2:5:1的比例在37°C和5%二氧化碳条件下共培养72小时。向共培养体系中加入EdU，使其终浓度为10 µmol/L，孵育16至20小时。将CD8交叉引物在4°C避光条件下，用预冷的FACS缓冲液重悬，于1,100 ×g离心两次，每次5分钟，并在冷FACS缓冲液中染色表面标志物，染色时间为20分钟。

用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 100 微升含活力可固定蓝色染料的 PBS 中，孵育 30 分钟。用 3 毫升含 1% BSA 的 PBS 在流式管中洗涤细胞悬液一次。加入 100 微升 4% 多聚甲醛，固定细胞 15 分钟。

将细胞在100 µL皂苷类通透和洗涤试剂中孵育15分钟。加入500 µL反应混合液，在避光条件下孵育30分钟。洗涤后，将细胞重悬于100 µL皂苷类通透和洗涤试剂中。

根据细胞的FSCA和SSCA特性识别目标细胞。然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和团块对分析的干扰。绘制525至50纳米发射带通滤光片面积与SSCA以去除死细胞。

使用530至30纳米和575至26纳米发射带通滤光片密度图，检测细胞对CD8a和CD3的阳性表达。使用660至620纳米带通发射滤光片，通过单参数直方图分析Alexa Fluor 647标记的EdU掺入情况。CD11c阳性的树突状细胞在37摄氏度下有效吞噬了凋亡的MCA 205癌细胞，表明在癌症免疫早期循环阶段存在温度依赖性的吞噬作用。

吞噬作用后，树突状细胞表现出CD86和MHC II类分子水平升高，同时PDL1水平降低。一旦被成熟的树突状细胞激活，CD8+ T细胞的克隆扩增明显，增殖率约为20%。利用肿瘤芯片模型，观察到这些T细胞对癌细胞释放的警报素产生的趋化反应。

从共培养物中回收CD8交叉引物后，将其在10毫升完全生长培养基中以1,100 G离心10分钟。将一千万个总细胞重悬于100微升死细胞去除微珠中，在室温下孵育15分钟。

将分离柱置于磁性分离器中，并用结合缓冲液冲洗。将细胞悬液转移至分离柱中，收集穿流液。洗涤柱子后，收集未标记的穿柱细胞，并与先前收集的穿流液合并。

在完全培养基中，将富集的活CD8交叉呈递细胞以1,100 ×g离心5分钟。计数后，按2:1的比例将CD8交叉呈递细胞与新鲜的MCA 205细胞共同接种于12孔板中，在37°C、5% CO₂条件下培养72小时。在收获CD8效应细胞前，向肿瘤免疫细胞共培养体系中加入莫能菌素和布雷菲德菌素，共同孵育6小时。

然后，收集CD8效应细胞，于1,100 G离心两次，每次5分钟。将细胞重悬于三种不同的冷FACS缓冲液配制的一抗混合液中，4°C避光孵育20分钟。向来自混合液C的细胞悬液中加入100微升固定液，4°C避光孵育20分钟。

将细胞重悬于预冷的洗涤缓冲液中，在4°C下孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次后，向细胞沉淀中加入含活力可固定Aqua染料的100 µL PBS，孵育30分钟。根据细胞的FSCA和SSCA特性鉴定目标细胞。

然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和细胞团块。利用525至50纳米发射带通滤光片与SSCA，去除死细胞。使用660至20纳米和780至60纳米发射带通滤光片，在双参数密度图中检测细胞CD8a和CD3的阳性表达。

分别对混合物 A、B 和 C 进一步分析细胞的 CD44、CD25 和 CD69 标记物，以及 CD137 标记物和干扰素γ阳性细胞与颗粒酶 B。对于肿瘤杀伤实验，在共培养体系中加入实时细胞死亡定量染料。将培养板置于活细胞分析系统中升温至 37°C 后，每两小时进行一次数据扫描，持续最长 72 小时。

将细胞在1,000 G条件下离心两次，每次5分钟。用20 µL冷FACS缓冲液对细胞进行表面标志物染色，并在4°C避光孵育20分钟。然后加入活力染料碘化丙啶，用于细胞门控策略的染色。

根据细胞的FSCA和SSCA特性识别目标细胞。然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和细胞团块对分析的干扰。使用450至50纳米的发射带通滤光片检测CD45阴性的癌细胞。

在单参数直方图中，使用610至620纳米带通发射滤光片，通过平均荧光强度分析细胞对碘化丙啶的摄取情况。通过多参数流式细胞术检测，早期活化标志物CD69、晚期活化标志物CD44和CD25、膜表面CD137以及CD107a肿瘤反应性标志物的表达水平均得到增强。细胞内细胞毒性分子颗粒酶B和干扰素γ阳性水平随时间进行性且显著升高，在共培养72小时时达到表达峰值。

同源共培养的MCA 205细胞经历了显著水平的CD8效应细胞介导的死亡。