肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

该简单体外共培养模型的总体目标是模拟体内肿瘤微环境的特征，富集特定的细胞亚群，并研究细胞间通讯的各种模式。该方法有助于回答癌症和放射生物学领域中的关键问题，特别是关于癌相关成纤维细胞生成的潜在因素以及对治疗药物的响应机制。该技术的主要优势在于，无需使用诱导应激的荧光标记或细胞分选方法，即可从混合细胞培养物中获得独立的细胞群体。

首先用 5 毫升 PBS 将目标细胞培养物洗涤两次。第二次洗涤后，在室温下加入 1 毫升室温的胰蛋白酶-EDTA，作用 2 分钟以使细胞脱离。然后加入 9 毫升完全培养基终止反应，并轻轻吹打培养瓶表面 10 次，使细胞充分解离。

计数后，用新鲜培养基将细胞稀释至每毫升2.5 × 10⁵个细胞的浓度，并将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于新鲜生长培养基中，该培养基需添加50%胎牛血清，细胞浓度为每70微升培养基含2.5 × 10⁵个细胞。接着，将相应实验孔径的插入式培养小室从包装中取出，放入多孔板的各个孔中，并盖好培养板。

然后用双手握住培养皿，轻轻将培养皿倒置，直至插入物底部朝上。移除培养皿的底部。用一只手使用无菌镊子固定一个插入物，另一只手用微量移液器缓慢吸取70 µL细胞至移液器吸头中。

然后将细胞缓慢滴加到此时位于上方的插入式培养小室的表面。接种完每个插入式培养小室后，小心地将培养皿底部放回原位，并将倒置的培养皿在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下孵育30至45分钟。孵育结束后，在超净生物安全柜中小心地将培养皿重新倒转，使插入式培养小室的底部朝下。

然后缓慢而小心地将每个小室的底部浸入 2 毫升预热的完全培养基中，并将培养皿放回湿化培养箱内。48 小时后，将每个孔底部的培养基更换为 2 毫升新鲜生长培养基。待所有培养基更换完毕后，在 1 毫升新鲜培养基中将 2.5 × 10⁵ 个目标第二细胞群体接种至小室顶部，并将培养皿放回培养箱中。

24、48 和 96 小时后，将每个小室顶部的培养基更换为 1 毫升新鲜的完全培养基，将每个孔底部的培养基更换为 2 毫升新鲜的完全培养基。共培养 120 小时后，将每个小室依次转移至含有 1 毫升 PBS 的独立 35 毫米细胞培养皿中。

用一毫升 PBS 清洗插入物的底部和顶部表面。为收集在插入物底部生长的细胞，将插入物底部朝下放入 200 微升室温的胰蛋白酶-EDTA 溶液中。室温孵育两分钟后，加入 800 微升完全培养基以终止反应。

然后将插入物保持轻微倾斜角度，用移液器轻轻将上清液在细胞表面吹打10次，收集培养皿中的细胞。当所有插入物均处理完毕后，将细胞重悬于生长培养基中，浓度为每毫升含2 × 10⁵个细胞。随后，向无菌的单个玻璃盖玻片上各加入250 µL细胞悬液。

将盖玻片放入加湿的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，在超净工作台中，向培养皿中小心加入两毫升完全培养基，于37摄氏度、5%二氧化碳及加湿条件下培养48小时。随后用PBS洗涤细胞三次。

第三次洗涤后，在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，随后用 Tris 缓冲盐水洗涤五次。最后一次洗涤后，在室温下用含 0.1% 皂苷的 0.25% Triton X-100 处理细胞 5 分钟以进行透化，接着在封闭液中室温孵育 1 小时。随后，将样品在封闭液中加入目标一抗，于 4 摄氏度孵育过夜。

第二天早晨，用洗涤液洗涤三次，每次三分钟，以去除未结合的一抗；随后在封闭液中，于室温下孵育一小时相应的二抗。孵育结束后，按照上述方法洗涤去除未结合的二抗，并将盖玻片用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封固在单独的载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘。

然后在倒置显微镜下使用63倍油镜，并借助外部光源进行荧光激发，对细胞成像。该系统可使两种不同的细胞群体在细胞培养小室的多孔膜两侧分别生长至少120小时，当使用孔径为0.4或1微米的小室时，可维持膜两侧细胞群体纯度高于99%。然而，孔径为3微米的小室孔径较大，足以允许细胞穿过膜迁移，本实验中使用GFP阳性的一个人类乳腺癌细胞系观察到了这一现象。

0.4 微米孔径的插入式培养小室还可限制插入膜两侧细胞培养物之间功能性缝隙连接的形成，使细胞间的通讯仅限于分泌因子。然而，孔径为1微米和3微米的插入式培养小室则允许细胞通过缝隙连接实现功能性耦合，这在共培养体系中表现为荧光标记物穿过膜的转移。重要的是，该系统可有效用于在正常人类二倍体成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养后，生成癌症相关成纤维细胞，这一点已通过与人乳腺癌细胞共培养的成纤维细胞中caveolin-1表达水平降低得到证实。

在进行该实验操作时，选择孔径大小适合所研究问题的插入式培养小室非常重要。同时，需观察插入小室底部在促进细胞贴附的培养基中出现的首个细胞群体。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如免疫印迹、原位免疫荧光染色，或大多数其他基于细胞的检测方法，以探究蛋白质表达水平的变化、侵袭与迁移能力的改变，或对治疗药物反应的差异等更多科学问题。

该技术建立后，为癌症生物学和辐射生物学领域的研究人员探索肿瘤微环境形成与演化的相关因素提供了途径，而在我们的研究中，则有助于揭示电离辐射从受照靶细胞向邻近旁观者细胞传递有害效应的机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备混合细胞共培养体系、维持共培养状态，并从共培养体系中收获高纯度富集的细胞群体以用于后续分析。请务必注意，操作人源细胞株或细胞系可能存在生物安全风险，实验过程中应穿戴适当的个人防护装备，并严格遵守相应的生物安全规范。

感谢观看，祝您的实验顺利。