基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

我们的研究致力于改进多孔基底电穿孔技术。研究表明，利用微米和纳米通道来实现电穿孔的局部化具有显著优势，但仍存在一些尚未解决的问题，尤其是在电穿孔过程的中间阶段对效应进行监测和表征方面。最近的一些进展包括我们采用跨上皮电学阻抗监测技术，以及利用基于纳米通道的电穿孔来生成外泌体或测量细胞膜张力。

PSCP 实验目前仍主要依赖转染前后的荧光成像来确定递送效果和细胞存活率。此外，许多基于 PSCP 的研究对脉冲参数的报告不足，且鲜有研究致力于验证常见细胞类型的最优参数。我们所针对的主要研究空白在于，缺乏关于 PSEP 在细胞恢复阶段影响的系统性报道。

然而，我们对 TEEI 测量结果的分析表明，TEEI 的变化与细胞活力和递送效率相关，这使我们也能确定最佳的 PSEP 波形参数。今后我们的主要研究重点将是明确导致 TEEI 升高的机制。理想情况下，这些发现将有助于进一步优化 PSEP 工艺，实现更高效的递送。

开始纤维连接蛋白包被时，选取12个插入式培养小室和两个24孔板。将插入式培养小室放入一个孔板中，排列成两行，每行六个。在1.5毫升离心管中，将52微升纤维连接蛋白储备液与1.2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制浓度为1微克/毫升的纤维连接蛋白溶液。

向每个插入物中加入100微升纤连蛋白溶液。将插入物置于培养板中，在37摄氏度下孵育3小时。孵育结束后，移除每个插入物中多余的纤连蛋白溶液。

用移液器向每个小室中加入 100 微升无菌蒸馏水，清洗小室两次。按照与加液相同的顺序移除液体，以确保各小室之间的清洗时间一致。随后用 100 微升细胞培养基清洗小室，然后从小室中移除培养基。

接下来，将200微升A种子液加入插入式培养皿中，用于31细胞悬液的阴性对照；用移液器将200微升细胞培养基加入插入式培养皿中。使用永久性记号笔，在第二块培养板上画一条线，将其分为两列，每列宽三个孔，并将每列进一步划分为若干行。

在网格中用相关参数标记每个区域。向每个孔中加入一毫升细胞培养基。将插入物从制备板转移至已标记实验板的相应位置，并在37摄氏度下孵育12小时。

首先，用移液器将1.5毫升浓度为0.1毫克/毫升的碘化丙啶溶液加入电极阵列的每个孔中。将插入物放入电极阵列的每个孔内，使插入物的脚嵌入对齐凹槽中，确保插入物与孔的上表面齐平。将顶部电极印刷电路板拧紧至电极阵列孔的上方，并将电极阵列连接至多孔基底电穿孔（PSEP）装置。

将电极阵列放入37摄氏度的培养箱中进行温度平衡。在界面左上角的“membrane”下拉菜单中点击，选择400纳米GBO。在界面右侧的“post pulse time duration minute”编辑框中输入1。

现在点击运行按钮，当系统提示时，为1至3号和4至6号孔输入相应的名称，然后点击确定以开始实验。一小时后，从培养箱中取出电极阵列，将插入物转移回实验板中的原始位置。在200微升离心管中，将2微升Hoechst 33342和5微升钙黄绿素AM与123微升细胞培养基混合。

轻轻将10微升染色液用移液器加入每个电脉冲后插入孔中，并将插入孔放回培养箱孵育5分钟，随后将培养板转移至配备5倍物镜的荧光显微镜的载物台。使用明场及各染料的荧光进行成像。向电极阵列的每个孔中加入1.5毫升细胞培养基。

将细胞样本小室插入第1至第3孔，对照小室插入第4至第6孔，确保小室底部凸脚嵌入对齐凹槽中。将顶部电极印刷电路板拧紧至电极阵列板的顶部，并将电极阵列连接至PSEP设备。将电极阵列置于37摄氏度培养箱中进行温度平衡。

在 gooey 界面左上角的膜下拉菜单中点击，然后选择 400 纳米 GBO。接着点击运行按钮，当系统提示时，分别为 1 至 3 号孔和 4 至 6 号孔输入适当的名称，然后点击确定以开始实验。一小时后，从培养箱中取出电极阵列，并将插入物转移回实验板中原来的孔位。

将宿主细胞32342、钙黄绿素AM和碘化丙啶加入细胞培养基混合液中，轻轻吹打混匀后，向每个电穿孔后的插入式培养小室中加入10 µL染色液，再将小室放回培养箱中孵育5分钟。使用荧光显微镜对细胞样本小室进行成像，分别采集明场图像以及各染料的荧光信号。优化后的健康细胞曲线显示，跨上皮电阻（TEEI）在脉冲序列电穿孔（PSEP）成像后未出现低于基线的情况，且TEEI上升幅度最大；细胞单层成像结果显示细胞死亡极少，细胞单层健康且完全汇合。优化后的非健康状态数据则表现为TEEI响应减弱。

在PSEP成像后发现，由于单层细胞数量较少，细胞死亡接近于零，但递送效率降低。使用未优化的波形导致TEEI反应显著下降，表明细胞死亡明显增加，递送效率下降。