连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

该方法可帮助研究人员确定特定细胞类型所需的最优电穿孔脉冲条件，同时减少对传统经验性实验方法的依赖。该方法利用微电穿孔技术，制造出一种可扩展的微流控驱动装置，能够在整个电穿孔过程中实时电学监测细胞膜通透化的程度。本实验操作将由我实验室的硕士研究生 Kishankumar Busha 进行演示。

首先，使用匀胶机的真空系统将硅片固定在匀胶机的卡盘上。然后设定匀胶程序。接着，将4 mL的SU-8 2010光刻胶滴加到硅片中心，运行程序。

当系统完全停止后，关闭真空。然后将带有二维微流控通道设计的光掩模固定在掩模支架上，并将涂有 SU-8 光刻胶、涂层面朝上的硅片放置在晶圆卡盘上。设置曝光参数为 150 毫焦每平方厘米，启动设备运行。

紫外光照射后，将硅片浸入SU-8显影液中，轻轻搅拌3至4分钟。随后将硅片从溶液中取出，并用异丙醇冲洗表面。接着，将硅片放入150摄氏度的烘箱中烘烤30分钟，进行硬烘。

然后让其冷却至室温，再使用触针式轮廓仪测量通道侧壁的精确高度和斜率。接着，将一毫升光刻胶滴加到载玻片表面，并再次运行程序。待系统完全停止后，关闭真空泵并取下载玻片。

将带有二维电极设计的光刻掩模固定在掩模 holder 上后，将涂有 S-1818 光刻胶且光刻胶面朝上的玻璃晶圆插入并固定在晶圆卡盘上。设置曝光参数为 215 毫焦耳每平方厘米，运行曝光设备。曝光完成后，将玻璃片浸入 MF-319 显影液中显影两分钟，并轻轻摇动以促进显影。

然后移除玻璃晶圆，并用去离子水冲洗其表面。最后，将玻璃载片放入150摄氏度的烘箱中进行坚膜烘烤，确保待测基底表面朝上。30分钟后，从烘箱中取出载片，并避免光照。

将玻璃载玻片浸入聚四氟乙烯容器中盛有的10比1缓冲氢氟酸溶液内，蚀刻一分钟。然后将玻璃载玻片转移至去离子水中，清洗三次。接着，使用物理气相沉积系统，以每分钟100埃的速率溅射钛8分钟，再以每分钟200埃的速率溅射铂10分钟。

然后，为了去除光刻胶，将镀有金属的玻片浸入丙酮溶液中10分钟，并对溶液进行超声处理以产生搅动。如有必要，可使用浸有丙酮的擦拭布清除任何残留物。接下来，进行聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模塑：在置于电子天平上的一次性容器中，按10:1的质量比将PDMS弹性体基料与固化剂混合。

然后，将PDMS溶液倒入硅晶圆上，并将混合物置于真空环境中以去除气泡。在65摄氏度下固化至少四小时后，用剃须刀片的尖端切下成型的PDMS，并从硅晶圆上剥离。接着使用锋利的活检打孔器，去除器件入口和出口处的PDMS。

接下来，设置等离子体发生器以进行PDMS键合。然后将PDMS和带有电极的玻璃载片放入系统中，使功能面朝上，并运行程序。程序完成后，取出器件，并使用体视显微镜快速将通道结构与电极对齐。

从PDMS中心向两侧均匀施加压力，以去除键合界面处任何不需要的气泡。收集HEK293细胞，离心后将沉淀重悬于电穿孔缓冲液中，浓度约为每毫升五百万个细胞。接着，加入编码GFP的质粒DNA，使其终浓度为20微克每毫升，并轻轻混匀。

然后将血浆-DNA细胞悬液转移至一个立方厘米的注射器中用于实验。通过载物片夹将微流控装置放置在显微镜载物台上。接着打开电荷耦合器件（CCD）相机，并将微流控通道调至焦点清晰。

接下来进行单细胞电穿孔时，将注射泵的流速设置为每分钟0.1至0.3微升，以确保单个细胞顺利通过电极组。然后设定初始且最低电能电穿孔脉冲的脉冲参数。根据预先确定的每次脉冲应用所对应的细胞检测数量进行操作。

每种测试条件结束后，从微装置出口吸取细胞，并用恢复培养基重新填充出口。依次更换电穿孔脉冲条件并重复操作，直至完成所有电穿孔脉冲条件的测试。随后，确定用于高通量基于群体反馈的电穿孔脉冲参数。

对于基于群体反馈控制的电穿孔，将注射泵的流速设置为每分钟一至三微升，并将脉冲幅度设置为优化条件。然后关闭触发模式，并将脉冲宽度设置为与细胞通过时间相匹配。在完成所需数量的细胞电穿孔后，关闭注射泵和函数发生器。

然后将出口储液槽中的细胞转移至装有预热恢复培养基的适当大小的细胞培养瓶或培养板中，并将培养瓶或培养板放入培养箱。进行数据分析时，将数据导入分析软件，针对每种电脉冲条件生成电流随时间变化的曲线图。随后确定细胞膜通透化的程度，绘制涵盖所有测试脉冲条件的细胞膜通透化图谱，并验证最佳的电脉冲条件。

孵育结束后，使用 FITC 和远红滤光片捕获荧光图像，并通过人工或算法分析图像集。此处重点介绍针对单一脉冲幅度的单细胞水平通透性检测的操作原理。每次电穿孔脉冲参数处理后，均测试下一个更高能量的电穿孔脉冲。

HEK293细胞的细胞膜通透性图谱显示，施加的电能与细胞膜通透化程度之间存在明显相关性。在本实验中，确定1.8千伏/厘米的电场强度和670微秒的脉冲时长为最佳条件。在这些参数下，实现了70%的电转染效率。

与电场强度为每厘米0.4千伏、脉冲持续时间为三毫秒的条件相比，24小时时的电转染效率低于5%。术语“工艺流程”（recipe）常用于描述微加工工艺的具体步骤，强调了遵循或优化每个步骤以成功制备功能器件的重要性。该电穿孔技术可应用于其他生物医学研究项目，例如CAR-T细胞的制备与检测，或CRISPR-Cas9基因编辑技术的优化与验证。这种微电穿孔技术能够通过电学手段检测不同类型细胞对电脉冲条件的响应，并将这些信息与临床相关分子货物的递送效果相关联。