在脑电图控制睡眠下通过光生物调节促进小鼠大脑毒素淋巴清除

本研究中，我们提出了一种在脑电图（EEG）控制下，于睡眠期间对脑膜淋巴管及脑部引流进行光刺激的创新技术。睡眠是大脑引流及清除功能自然激活的状态，而这种功能在多种中枢神经系统疾病中会减弱。因此，有必要开发在睡眠期间治疗脑部疾病的技术，以最有效地促进脑组织通过脑脊液流动清除毒素和代谢废物。

我们开发的利用光生物调节技术调控脑部淋巴系统（MLD）功能以促进脑部引流的方法，为多种与脑部引流功能障碍和抑制相关的中枢神经系统（CNS）疾病提供了新的非药物替代治疗可能性，包括脑血管性脑损伤、帕金森病、多发性硬化症、糖尿病等。开始硬件组装时，将发光二极管（LED）焊接到印刷电路板（PCB）上，并将LED和磁铁安装到3D支架中。然后，将电阻连接在LED阳极与Arduino的5伏端口之间。

接下来，将发光二极管（LED）的阴极连接至金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）的漏极，并将MOSFET的源极固定到接地端。在MOSFET的栅极与接地端之间连接一个下拉电阻后，将MOSFET的栅极连接至Arduino的3号引脚。然后将液晶显示器（LCD）按键扩展板连接到Arduino上，并将带有LCD按键扩展板、MOSFET及LED连接器的Arduino电路板插入外壳中。

最后，下载 Arduino 程序并通过 Arduino 集成开发环境打开。选择正确的通信端口并烧录固件。将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中的加热垫上，并在眼睑处涂抹眼用软膏，以防止眼球干燥。

从鼻骨至枕骨区域剃除头部毛发，使用氯己定和酒精交替消毒暴露的皮肤，每种溶液各擦拭三次。使用直头解剖剪剪开头皮，用显微镊夹住头皮并清除颅骨上的筋膜组织。使用直径为1.3毫米的钻头，在双侧颞骨上根据两对螺钉的坐标位置各钻两个孔。

将脑电图（EEG）螺钉及其导线在酒精中放置15分钟，随后放入生理盐水中。将四个带电极的镀银螺钉插入孔中，深度为1毫米。使用牙科丙烯酸树脂将螺钉固定在颅骨表面，然后将脑电图记录传感器连接到动物的鼻部。

30分钟后，使用弯头镊子将肌电图电极用牙科丙烯酸树脂固定在眼轮匝肌背面。将脑电图电极连接并固定至传感器的镀银凹槽内。最后，将小鼠置于加热垫上以维持体温，直至动物完全从麻醉中恢复。

七天后，使用牙科丙烯酸树脂和杜蒙特镊子将直径为五毫米的金属板固定在小鼠颅骨的枕骨上。为制备慢性导管，从胰岛素针头斜面端一侧起，在距其两毫米处标记一段位置。将胰岛素针头从斜面尖端一侧插入持针器，直至标记段位置。

将一根2厘米长的PE-10聚乙烯导管套在针头剩余的整个长度上。用生理盐水充满导管，并用塑料帽覆盖。在植入过程中，在相应坐标位置钻一个直径为1.5毫米的环钻孔。

将PE-10聚乙烯导管置于立体定位仪夹持器中，并插入小鼠颅骨。随后用牙科丙烯酸树脂固定，并静置15分钟使其硬化。将任意商用脑电图（EEG）记录系统连接至小鼠头部的连接器，并设置脉冲宽度调制（PWM）占空比的要求值。

监测脑电图信号，并等待出现 delta 节律活动。若观察到非快速眼动（NREM）睡眠，则启动光生物调节（PBM）过程；当 NREM 睡眠转变为快速眼动睡眠或觉醒状态时，停止该过程。进行共聚焦成像前，首先将一根 10 厘米长的导管连接至胰岛素针头。

使用带有29号针头的汉密尔顿注射器，准备5 µL荧光标记的β-淀粉样蛋白，用于注入导管。固定小鼠前肢后，通过针头将导管与植入的慢性导管连接。将导管连接至微量注射器，并将小鼠放入单独的盒子中。

在微量注射器菜单中将注射速率设置为 0.1 微升每分钟，然后按“开始”按钮向右侧脑室注射 FA-beta。给予 FA-beta 后，按照算法使用 LED 进行 61 分钟的光生物调节（PBM）。随后通过尾静脉注射任意示踪剂以标记脑血管。

安乐死后，使用锋利的直剪刀沿气管在皮肤上做一个小的横向切口，同时用直的钝头镊子夹住皮肤。然后用直剪刀沿颈部全长做一纵向切口。使用弯头镊子提起唾液腺，并小心地将其从结缔组织中分离出来。

在切口的开放部位放置伤口拉钩，并固定以推开周围组织。使用两把弯头镊子从颈部两侧夹住并检查气管与胸锁乳突肌之间的区域。用末端钝直的直头镊子摘除两侧的深部颈淋巴结，并从结缔组织上剪下。

最后，将结点置于含有生理盐水的培养皿中，并用水平放置的盖玻片覆盖，以进行共聚焦显微镜观察。30 焦耳/平方厘米的光照剂量对促进清醒成年雄性小鼠脑内 FA-β 的淋巴清除作用最为显著。在增强 FA-β 清除效果方面，1,050 纳米波长的脉冲模式比其他波长以及相同波长下的连续模式更为有效。

在老年小鼠非快速眼动（NREM）睡眠期间进行为期10天的经颅光生物调节治疗，可显著降低可溶性FA-β水平，使其达到年轻成年小鼠的水平。若在清醒期间进行该治疗，则未观察到此效应。