测定假复层肺气道上皮的纤毛功能与膜不通透性

我们的研究旨在测量假复层气道上皮的两个关键生物物理特性，这些特性可通过在气液界面分化正常人支气管上皮细胞获得。我们利用假复层气道上皮鉴定了不同呼吸道病毒的特征。例如，呼吸道合胞病毒引发的细胞骨架炎症，这是一种支气管炎的非经典机制。

我们还发现杯状细胞增生会增加慢性阻塞性肺疾病气道上皮中SARS-CoV-2的复制。我们的研究重点是阐明呼吸道合胞病毒（RSV）驱动的细胞骨架信号通路调控机制，以确定可用于对抗RSV感染及病毒诱导性细支气管炎的新型治疗靶点。首先，取正常人支气管上皮（NHBE）细胞悬液。

使用P200移液器，将重悬的50,000个细胞加入200微升完全气道上皮细胞（AEC）培养基中，接种至小室的顶端侧。将细胞置于37°C、85%至95%湿度的二氧化碳细胞培养箱中孵育。待细胞达到汇合状态后，用无菌镊子将小室转移至空孔中。

使用 P1000 移液器吸除所有基础 AEC 培养基。然后向基础室中加入 500 微升新鲜的完全 ALI 分化培养基，该培养基需添加 2% 青霉素-链霉素和 1% 两性霉素 B。使用无菌镊子将插入式培养小室转移至已加入完全 ALI 培养基的基础室中。

使用 P200 移液器轻轻吸出小室顶部的 AEC 培养基并进行孵育。48 小时后，用无菌镊子将插入物转移至一个新的无菌小室中。使用 P1000 移液器吸去旧培养基，并加入 500 微升新鲜的完全 ALI 培养基。

使用无菌镊子将小室放回孔中，并加入新鲜培养基。第26天，使用P200移液器向小室的顶端加入100 µL DPBS。在37°C、湿润的细胞培养孵育箱中孵育30分钟。

然后，使用 P200 移液器吸除 DPBS。首先，打开显微镜、连接的计算机和环境培养箱。打开培养箱门，将含有 NBHE 细胞插件的培养板放置在显微镜载物台上。

将培养板放入载物台后，关闭腔室。然后使用显微镜载物台操作旋钮移动培养板，使插入物进入视野。在计算机屏幕上，单击 SAVA 系统图标以打开 SAVA 程序。

在软件界面中，点击“配置实验”。在下一个选项卡中，点击“创建实验”。然后，在新选项卡中，在“输入实验目录名称”字段中输入数据将要存储的目录，并在“输入实验描述”字段中填写详细信息，然后点击“确定”。现在，点击已创建并在“实验”部分目录下显示的实验。

随后，点击“修改”按钮，在“样品描述”字段中填写样品详细信息。点击“添加”，然后点击“退出”以关闭该选项卡。在主软件界面中，从“实验”槽位的下拉菜单中选择已创建的实验。

然后，点击“录制视频”以在计算机屏幕上监测纤毛搏动频率。屏幕将显示清晰的纤毛运动图像。对于每个插入样本，在每秒120帧的条件下，随机记录六个不同视野区域，每个持续2.1秒。

单击“保存视频”以监测纤毛搏动频率数据。要分析数据，请在软件界面中单击“分析视频”，然后在下一个选项卡中单击“确定”。接着转到下一个选项卡，单击“全部分析”。

下载计算机 SAVA 数据采集文件夹中为每个实验生成的电子表格。数据展示时采用高斯平均频率。健康成人和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的气道上皮纤毛摆动频率均达到至少三赫兹，表明其纤毛功能具有可比性。

首先，使用电源开关打开 EVOM2 伏欧表。将测试电阻器连接到 EVOM2 的输入插槽。监测 EVOM2 屏幕上的读数。

如果读数高于或低于 1,000，请使用镊子调节 EVOM2 上的 ADJ 开关，直至显示均匀的 1,000 读数，以校准设备。现在，取一个空插件用于实验对照读数。使用 P200 移液器，向空插件的顶端侧加入 100 微升 DPBS。

然后，使用 P1000 移液器向基底侧加入 500 微升 DPBS。之后，断开测试电阻器，并将 STX2 电极连接到 EVOM2 的输入插槽。接着，用 70% 乙醇轻轻清洁 STX2 电极。

将STX2电极插入含有DPBS的空插件中，短电极腿置于顶端部分，长电极腿置于基底部分。现在记录EVOM2屏幕上的稳定读数。接着，使用P200移液器向插件的顶端侧加入100微升DPBS。

将STX2电极插入含有26天分化气道上皮的培养插件中，操作如前所述。然后记录EVOM2屏幕上的稳定读数。慢性阻塞性肺疾病（COPD）成人患者的跨上皮电阻值升高，表明COPD中细胞膜通透性增强。