生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备与结构评估

本方案旨在降低细胞培养实验的入门门槛，使研究人员能够评估和表征在动态微流控环境中培养的贴壁细胞单层。该技术的主要优势在于，可对细胞单层特性进行定性和定量评价，为后续依赖于单层细胞的实验提供基础。本方法能够在体外重现肺泡上皮结构，从而可用于探索急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及呼吸机相关性肺损伤（VILI）过程中的动态响应。

首先，获取一个单通道流控阵列。在超声波清洗仪中清洗盖玻片表面。将盖玻片在室温下浸入聚-D-赖氨酸溶液中五分钟。

然后在 60 °C 下干燥 30 分钟。接着，在 Mylar 间隔片上粘贴双面胶带。按照文稿中所述方法对盖玻片进行激光切割，并确保通道切口精确对齐。

将矩形盖玻片贴附到底部最外侧的粘性胶带上。使用已剥离的粘性纸覆盖仍暴露的胶带部分。组装完成后，对整体结构施加均匀且稳固的压力。

使用装有去离子水的注射器冲洗通道。将通道腔室置于紫外灭菌器中灭菌30分钟。采用无菌操作技术，用PBS配制的人纤连蛋白溶液处理通道，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。

在无菌超净工作台中，使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基制备 NCI H441 细胞悬液。取 0.25 毫升该细胞悬液填充通道及部分进样口。利用明场显微镜观察，确认细胞已在通道内均匀分布。

将培养基储液槽和旋塞阀连接至通道。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下开始培养通道。使用可编程注射泵，从通道中抽出废培养基，并将无菌培养基储液槽中的新鲜培养基通过通道入口注入通道。

在化学通风橱中，将4%甲醛溶液用DPBS稀释，配制1%溶液，并储存于适当标记的离心管中。以类似方法配制2%甲醛溶液。将甲醛溶液转移至适当标记的5毫升注射器中。

用一个独立的20毫升注射器吸取20毫升DPBS，用于后续洗涤步骤。接着，将微流控通道从培养装置中取出，并固定在化学通风橱中。为组装固定和染色装置，使用公型鲁尔锁扣转软管接头，将一段转移软管连接至三通旋塞阀的侧端口。

然后将旋塞阀连接到流路阵列的入口端口。使用相同类型的软管接头，将另一段转移管连接到现有旋塞阀的出口端口。最后，将现在指定为废液管的两段转移管的自由端固定到适合盛装化学和生物危害性废弃物的废液容器中。

确保旋塞关闭流路阵列的入口端口，并用DPBS冲洗废液管路。然后旋转旋塞以关闭废液管路，缓慢用2 mL DPBS洗涤细胞。再缓慢将2 mL 1%固定剂推过通道。

静置5分钟，随后用2%固定剂重复处理。然后用新鲜的DPBS洗涤细胞三次，操作如前所述。按照文稿中的描述配制0.1%皂苷溶液。

用20毫升注射器吸取额外的DPBS，用于后续洗涤步骤。用铝箔将试管包裹。向0.1%皂苷溶液中加入丝状肌动蛋白染色试剂鬼笔环肽（phalloidin）和细胞核染色试剂Hoechst。

然后将溶液转移至用铝箔包裹的注射器中。用少量透化和染色溶液冲洗废液管路。随后向微流控通道中加入两毫升该溶液。

用铝箔覆盖通道以避光。30分钟后，用两毫升DPBS冲洗通透溶液，每次5分钟，重复两次，然后轻轻干燥通道。使用微量移液器向微流控通道中加入少量软固化抗荧光淬灭封片剂，确保完全覆盖底部表面。

然后将通道末端密封。使用明场显微镜快速验证细胞层的完整性，再将通道放入容器中避光保存。通过采集参考扫描图像和z轴层扫图像，测试成像位置，直至达到理想的成像参数和条件。

以流道阵列基板为参考，在通道长度方向上的多个位置构建z轴层扫图像。最后，分析横截面数据、深度图数据以及任何其他相关特征，以评估细胞层的特性。该技术的成功应用可通过在距离入口和出口至少一厘米处的微流控动态培养环境中进行图像采集得以证明。

在一次典型的培养时间实验中，当细胞培养24小时时，观察到成功的单层形成。然而，当培养时间延长至48小时时，则出现了不理想的多层结构。从五个微流控通道成像位置收集的数据还揭示了培养时间延长与横截面积增加之间的关系，表明在48小时内即可能发生不均匀的层状形成或过度生长。

获得了微流控通道中央位置在培养24小时后的深度图，该图可用于对细胞层特征进行定性评估。本方案最关键的三个方面是：正确的通道构建、精确的培养与培养基流动条件，以及固定和染色装置的谨慎使用。在完成此操作后，可并行采用其他方法来验证所生成细胞单层的实验可行性，例如细胞电子基底阻抗传感（ECIS）或跨上皮电阻（TEER）。