实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

我们开发了一种用于定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实时显微镜方法。NETs在先天免疫防御中发挥重要作用。然而，现已明确NETs在组织中的积聚会促进多种炎症性和自身免疫性疾病的病理生理过程。

由于中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）具有重要的病理学意义，针对NETosis的拮抗剂研发日益受到关注。为了研究NETosis的抑制作用，我们开发了一种实时显微镜方法，用于定量检测人源NET的释放，从而能够以高通量的方式研究NETosis及其抑制过程。中性粒细胞是敏感性较高的细胞，在分离纯化过程中可能因机械性、微生物性及其他类型的应激而改变其对刺激的反应性。

因此，验证中性粒细胞分离方案以最大限度减少中性粒细胞活化显得尤为重要。该技术可用于研究健康个体以及患病个体中性粒细胞外陷阱（NET）的释放情况。此外，它还使我们能够研究不同生理刺激诱导的NET形成的动力学过程。

通过这种高通量显微技术，我们证明了NETosis拮抗剂CIT-013（一种靶向瓜氨酸化组蛋白H2A和H4的单克隆抗体）能够有效抑制NET的释放，其IC50为4.6纳摩尔。这表明该检测方法适用于NETosis拮抗剂的测试。从健康志愿者采集外周血至含锂肝素的采血管后，将血液转移至新的50毫升离心管中。

用DPBS冲洗肝素锂管，并将其转移至同一个50毫升离心管中，确保血液与DPBS的体积比为1:1。混匀后，将稀释后的血液小心加至密度梯度液上方。以400 ×g离心40分钟，离心过程中采用最小加速度和低刹车。

用10毫升移液管弃去上层血浆层。然后，使用塑料巴斯德移液管弃去外周血单个核细胞和密度梯度溶液。在用15毫升DPBS重新悬浮之前，轻轻振荡含有红细胞和中性粒细胞的层。

加入25毫升6%右旋糖酐和0.9%氯化钠溶液，通过倒置试管混匀。孵育25分钟后，用10毫升移液管将上层中性粒细胞层转移至新的50毫升离心管中，在500 ×g下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10毫升氯化铵-钾裂解缓冲液中。

加入40毫升相同的裂解缓冲液，在室温下通过持续倒置离心管直至溶液变为透明。将离心管以350 G离心10分钟。去除上清液后，缓慢地逐滴加入5毫升培养基，10%位于中性粒细胞沉淀上方，避免使中性粒细胞重新悬浮。

轻轻涡旋离心管，直至大部分位于中性粒细胞沉淀顶部的红细胞重新悬浮于培养基中。去除上清液后，将中性粒细胞沉淀重悬于10毫升培养基（含10%）中。完全重悬后，加入至多50毫升培养基（含10%），离心混合物，再将沉淀重悬于10毫升中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测缓冲液中。实验开始时，向96孔板的每孔加入0.001%的聚-L-赖氨酸溶液，在37摄氏度下孵育1小时。

用 200 微升 DPBS 将各孔洗涤三次，并将孔板置于空气中干燥。接着，用中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测缓冲液重悬所需数量的中性粒细胞。将用 NET 检测缓冲液配制的 4 倍浓缩 DNA 染料转移至各孔中。

向相应的孔中加入4倍浓缩的NETosis刺激物（溶于NET检测试剂缓冲液）。然后，向相应的孔中加入4倍浓缩的NETosis拮抗剂（溶于NET检测试剂缓冲液）和中性粒细胞悬液。以100 ×g离心微孔板2分钟。

然后，将培养板放入置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中的活细胞显微成像分析系统内。将含有中性粒细胞悬液的96孔成像板放入活细胞显微成像分析系统后，打开系统软件。点击“计划获取”，然后点击加号按钮以启动。

然后，选择“按计划扫描”并单击下一步。若要从零开始创建新容器，请在“创建容器”部分选择“新建”，然后单击下一步。在“扫描类型”部分，选择“标准”，然后单击下一步。

选择扫描设置为逐个细胞、无。图像通道，绿色为相差。采集时间，100 毫秒，物镜为 20 倍。

然后点击“下一步”。在“容器选择”部分，选择要扫描的容器类型，然后点击“下一步”。指定容器在抽屉中的位置，然后点击“下一步”。

在扫描模式部分，选择需要扫描的孔以及每孔的图像数量。单击下一步。在容器记录本部分，填写有关容器的信息。

输入板名称，然后点击下一步。在分析设置部分，选择“推迟分析至稍后”，然后点击下一步。在扫描计划部分，选择“创建新计划，以固定间隔进行扫描”，并在添加扫描至计划部分选择一小时。

选择在首次扫描后五小时停止扫描。当扫描信息正确时，单击“下一步”，然后单击“添加到时间表”。在获取中性粒细胞的相差和免疫荧光图像后，启动活细胞显微镜分析软件。

在界面中选择要分析的活细胞显微镜实验。选择“创建新分析定义”，然后点击“下一步”。接着，在“分析类型”部分选择基础分析器，然后点击“下一步”。

在图像通道部分，选择绿色，取消选择明场，然后点击下一步。打开图像图层窗口，选择绿色并取消选择明场。关闭绿色通道的自动缩放，手动设置最小值和最大值。

然后打开容器扫描时间窗口，选择代表含有 NETs 的阳性对照孔的图像。打开分析定义设置窗口，在对象名称中输入 NETs。对于分割方法，选择自适应（Adaptive）。

对于阈值GCU，选择三到五之间的数值，并将边缘分割开启（Edge Split On）设置在负10至零之间。接下来，进行清理时，选择孔洞填充（Hole Fill）至100平方微米，并将尺寸调整为负一像素。在滤器中，选择面积大于200平方微米、平均强度小于24.6、积分强度大于7,000的区域。

然后点击“预览当前”或“预览全部”以应用设置。将鼠标悬停在不同的NET结构上，调整分析参数，以优化NET的假阳性和假阴性结果。当NET分析设置正确后，点击“下一步”。

在扫描时间与孔板部分选择要分析的时间点和孔位，然后点击下一步。在保存并应用分析定义部分输入定义名称，然后点击下一步。当确认分析信息无误后，点击完成。

通过点击目标容器中的分析项来打开实验分析。然后，打开图形指标窗口。接着，点击加号按钮以创建一个指标。

当以百分比 NET 汇合度呈现数据时，在“指标”部分选择“面积”，在“数值”部分选择“汇合度”。当以发生 NET 形成的中性粒细胞百分比呈现数据时，在“指标”部分选择“对象计数”，在“数值”部分选择“每图像”。配置完指标设置后，在用户自定义指标部分，选择“NETs 面积汇合度”或“每图像 NETs 对象计数”。

分别从“选择扫描”和“选择孔”部分选取分析所需的所有时间点和孔。最后，点击“导出数据”。钙离子载体刺激诱导的NETosis比PMA更快，导致更高比例的中性粒细胞释放NETs。

由钙离子载体诱导的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在中性粒细胞质膜外更为弥散，而佛波酯（PMA）诱导的NETs则更靠近中性粒细胞质膜。当中性粒细胞被包被的免疫复合物、FMLP和单钠尿酸盐晶体激活时，NET水平升高呈现出一定趋势。23187诱导的NET释放可被CIT-013完全抑制，其半数最大抑制浓度为4.6 纳摩尔（nanomolar）。