利用损伤特异性分子信标对细胞裂解液中碱基切除修复活性进行定量实时分析

以下实验的总体目标是利用分子信标实时测量DNA修复速率和细胞核提取物的活性，这些分子信标在被修复后会发出荧光。碱基切除修复分子信标由脱氧寡核苷酸组成，呈茎环结构，包含一个单碱基损伤，其5'端连接六个羧基荧光素（6-FAM）基团，3'端连接Dabcyl基团。当分子信标折叠时，6-FAM的荧光通过Dabcyl以荧光共振能量转移（FRET）的方式被淬灭，从而不产生荧光。

为了评估DNA修复活性，将信标探针与含有修复酶的细胞核提取物共同孵育。DNA糖基化酶识别并切除信标探针中的DNA损伤位点。所产生的无碱基位点（ABA）可作为AP内切酶1（APE1）的底物。APE1识别后在ABA位点处切割DNA骨架，使携带六羧基荧光素（FAM）的DNA片段从发夹结构中游离解离。

脱离淬灭剂后，荧光信号增强，其增强程度与DNA修复水平成正比，可通过定量实时PCR仪进行实时检测。修复DNA损伤的能力对每个细胞和每个生物体都至关重要。在众多细胞DNA修复通路中，碱基切除修复主要针对因氧化或化学损伤而产生的受损碱基。阐明可能影响碱基切除修复的各个细胞组分的作用，是我们实验室研究的主要目标之一。

因此，准确而灵敏地测量DNA修复活性已成为我们实验室关注的重点。该检测方法能够提供此类数据。与现有的32PN标记结合凝胶电泳分析等方法相比，本技术的主要优势在于：无需使用放射性标记底物，可实时测量初级修复速率，且具有非常宽的动态范围。

此外，该方法可利用多种不同的荧光团和/或碱基损伤来确定底物特异性。我们已证明，该检测方法在不同条件下均具有高度的定量性和灵敏性。这种碱基切除修复分子信标检测适用于动力学分析。

该检测方法具有高灵敏度和高特异性，可实现准确的碱基切除修复定量，因此适用于修复抑制剂的筛选或验证。此外，该方法还可用于检测暗修复活性，并适用于组织及肿瘤细胞裂解液的功能性生物标志物测定。在设计用于本检测的分子信标时，可参考如下所示的长度为43个碱基的DNA寡核苷酸序列。

效果良好。该DNA序列并非唯一，但必须能够形成发夹结构。如图所示，通过插入特定的碱基损伤（如尿嘧啶或四氢呋喃）可实现特异性。

在距离5'端第六个位置，GC含量应至少为32%，且5'端不应放置GB碱基。5'端应连接六羧基荧光素（6-FAM），3'端应修饰以DABCYL。该序列将作为DNA修复蛋白的底物，以确保糖基化酶的结合与活性。

选择损伤位置时，应确保其距离发夹结构和 DNA 末端有足够的空间。茎部或发夹双链区的长度应至少为 15 个碱基对。推荐的环长为 13 个碱基。

对照分子信标应与实验用分子信标完全相同，唯一的区别是不含DNA损伤。因此，它不应被DNA修复酶识别。获得分子信标后，应进行质量评估，以确保这些信标在加热前不产生荧光。

为了确定最佳的熔解温度，提取过程中的所有步骤都应在冰上或4摄氏度条件下进行。为确保蛋白质稳定性，实验前应预先冷却。每个样品需准备两个1升烧杯、透析缓冲液、透析装置、微量离心机、离心管、注射器和针头。

标记15毫升锥形管并将其置于冰上。吸去细胞中的培养基，然后用7.5毫升预冷的PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，在每个培养皿中加入5毫升预冷的PBS，用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。

将细胞转移至预冷的15毫升锥形管中，然后在4°C下以500 × g离心5分钟。离心后，吸去上清液，并通过与相同管中已知液体体积进行比较，估算细胞压积。再次离心管体1分钟，然后用移液器吸除残留的PBS。

每50微升压紧细胞体积，用150微升核裂解提取试剂一重悬细胞沉淀。然后将重悬的细胞转移至预冷的1.5毫升离心管中，高速涡旋振荡15秒。涡旋后，将离心管置于冰上孵育5分钟，再涡旋振荡15秒，随后在4°C下以13,000 × g离心5分钟。

离心后，移除并弃去含有胞质组分的上清液。将沉淀重悬于重悬液中，每50微升压紧细胞体积加入75微升Nuke Buster裂解试剂，并加入1微升100倍浓缩的蛋白酶抑制剂混合液和1微升100毫摩尔的DTT。

高速涡旋振荡细胞15秒。冰上孵育5分钟，再高速涡旋振荡15秒，随后在4°C下以13,000 × g离心5分钟。离心后，用注射器将含有核蛋白的上清液转移至截留分子量为7,000的透析夹中。

接着，将 500 微升 1 摩尔的 DTT 加入 500 毫升预冷的透析缓冲液中，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌透析裂解液 90 分钟。90 分钟后，将透析盒转移至含有 0.5 升预冷透析缓冲液（含 DTT）的第二个烧杯中，继续在 4 摄氏度下轻轻搅拌透析 90 分钟。透析完成后，由于蛋白浓度较高，提取物可能出现结晶。

接下来，将新的注射器插入与注入样品时所用不同的端口，从透析盒中收集透析后的核蛋白溶液。在取出透析后的核蛋白溶液时，尽量包含外观浑浊的晶体物质。将样品分装至微量离心管中，每管20 µL，迅速在干冰上速冻，然后于-80°C保存，直至后续使用。

按照随附文件所述方法测定蛋白质浓度并进行质量控制。进行分子信标实验时，将细胞裂解液解冻，并用含有1毫摩尔DTT的基础切除修复反应缓冲液稀释至每微升含2微克蛋白质；同时，用基础切除修复反应缓冲液将分子信标稀释至200微摩尔。由于定量实时PCR仪通常不作为荧光计使用，需更改定量实时PCR仪的运行程序，设置为在37摄氏度下每20秒采集一次数据，至少运行180个循环。

然后在分子信标的最大荧光强度下，每20秒进行一次，共15个循环，以获取用于归一化的数据。将反应体系设为25 µL。接着使用应用生物系统软件在仪器上设置板型设计，选择标准曲线作为实验类型，并完成板布局。

本表中展示了一个示例，该示例也可在随附文档中找到。不要向选作标准曲线的孔中添加任何物质。将基础切除修复反应缓冲液、DTT、细胞裂解液（浓度为每微升含2微克）以及本实验中使用的所有分子信标置于冰上。

然后将DTT加入基础切口修复反应缓冲液中，使其终浓度为1毫摩尔。将含有DTT的15微升基础切口修复反应缓冲液移液至冰上预冷的适配光学Q-R-T-P-C-R板的每个孔中。接下来，根据板式布局，将信标探针移液至相应的孔中。

每种裂解液与分子信标或对照的组合均应设置三个重复孔。最后，将稀释后的核裂解液每孔5 µL加入相应的孔中。需要注意的是，所有分子信标试剂应始终保持低温，且裂解液应在最后一步加入到孔板中。

请注意，裂解液中含有具有活性的蛋白质，一旦将其移入反应混合物中，便会立即开始修复分子信标。因此，为尽量减少测量开始前发生的信标修复，保持所有试剂处于低温状态至关重要。待所有组分添加完毕后，用光学粘性封膜密封板板，并通过轻轻敲击板板进行混匀。

然后使用离心机进行短暂的10秒快速离心，使离心后的溶液聚集在试管或孔板底部。将孔板放入定量实时PCR仪中，开始检测。检测完成后，最好以Excel格式导出原始数据，并按照随附文档中的说明进行数据分析。在完成必要的计算后，以散点图形式绘制归一化的荧光数据，横轴为时间（单位：秒），纵轴为FAM游离百分比，并标出相应的误差范围，以评估LN 4 28细胞及指定为LN 4 28 MPG的MPG过表达细胞系的核提取物的DNA修复活性和质量。本视频中描述的实验采用含有APE1底物四氢呋喃的分子信标作为阳性对照。

如图所示，两种细胞系均表现出较强的APE1活性，表现为斜率陡峭，即针对MPG底物去除的DNA糖苷酶活性。在两种细胞系的核裂解液中均检测了次黄嘌呤（以HX表示）。每种裂解液分别使用碱基切除修复对照分子信标或碱基切除修复HX分子信标进行分析；对照信标中，LN 4 28显示为绿色，LN 4 28 MPG显示为紫色；对于次黄嘌呤信标亦同。

LN 4 28 显示为蓝色，LN 4 28 MPG 显示为橙色。结果以 A：平均荧光单位和 B：归一化荧光表示。在每种细胞中均观察到荧光随时间增加，提示发生了 HX 修复。

按照预期，裂解液与HX分子信标共同孵育。由橙色迹线指示的LN 4 28 MPG细胞系显示出更高的修复速率，表现为荧光信号积累更快，而亲本LN 4 28细胞系（MPG蛋白极低）则修复速率较低。因此，可通过细胞提取物实时测量特定修复蛋白对特定DNA损伤的修复速率，且非特异性DNA切割的背景信号极低。

观看本视频后，您应能够充分理解如何设计分子信标，并利用纯化的蛋白质或细胞裂解液来实时测量DNA修复速率。在分析过程中，必须评估动态范围和背景值，为此应设置对照反应，例如包含或不包含阳性与阴性对照信标的反应。考虑到孔与孔之间的变异性，建议将各孔的数据相对于输入值进行归一化处理。

这些由熔解温度的更精细步骤决定。此外，加入其他染料（如ROX染料）可校正由移液误差或检测器差异所引起的变异。该技术使我们能够阐明个体介导的切除修复组分对整体修复活性与修复能力的影响。

其灵敏度足以揭示微小的变化，而这些变化是传统方法无法检测到的。