利用多重荧光免疫组织化学染色法检测反复种植失败女性子宫自然杀伤细胞的四种亚型

在黄体中期，为胚胎着床做准备时，子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）会显著积聚。值得注意的是，这些细胞具有异质性。准确鉴定其表型对于理解子宫内膜容受性至关重要。

本研究旨在利用多重免疫组织化学染色检测四种子宫自然杀伤细胞亚型。免疫组织化学染色已广泛用于反映生殖失败女性子宫自然杀伤细胞的密度。然而，这种传统技术无法有效区分不同亚型的子宫自然杀伤细胞。

本研究采用多重免疫组织化学染色方案，可实现对四种不同亚型的子宫自然杀伤（NK）细胞进行鉴定。通过实施该方案，我们将评估反复种植失败女性与生育正常对照组之间子宫NK细胞亚型的差异。若发现存在显著差异，将进一步探讨这些子宫NK细胞亚型是否可用于预测种植失败的风险。

最终，我们的长期目标是开发一种诊断检测方法，用于评估子宫自然杀伤细胞的免疫状态，以判断子宫内膜容受性。首先，获取载玻片上的人类子宫内膜组织切片用于多重免疫组织化学染色，并在60摄氏度下烘烤组织切片两小时。随后，将切片依次浸入适当的溶液中进行脱蜡、水化和固定处理。

向耐热抗原修复盒中加入每种抗体对应的 200 毫升 AR6 或 AR9 缓冲液。将切片放入抗原修复缓冲液后，置于微波炉中高火加热至沸腾。盖上盒盖但留有缝隙，然后转低火加热 15 分钟。

待玻片冷却后，先用双蒸水冲洗，再用PBST冲洗。然后用吸水纸吸去多余的溶液，并用疏水屏障笔在组织周围画一个完整的圆圈。随后在室温下用3%过氧化氢孵育切片8分钟。

接着，加入封闭液，在室温下孵育10分钟。去除封闭液后，向每张切片加入150 µL第一抗体CD49a，使用1×抗体稀释液按1:1000比例稀释。在加入二抗之前，用吸水纸去除多余的水分。

在每张载玻片上加入四到五滴1X抗小鼠和兔辣根过氧化物酶二抗。然后将酪胺信号放大液（TSA染料）用扩增稀释液按1:100稀释。向每张载玻片加入150微升稀释后的溶液，并进行孵育。

为了去除未结合的荧光染料，将切片置于耐热盒中，加入200毫升AR6缓冲液，在微波炉中高温加热2分钟。随后将微波炉调至低功率继续加热15分钟。然后逐滴加入用PBST稀释的150微升DPI工作液。

将切片置于避光处完全干燥，约30分钟。滴加一滴抗淬灭荧光封片剂，小心地加盖盖玻片。首先，使用目标抗体对已封片的子宫内膜组织切片进行染色。

打开成像仪，并根据TSA染料选择合适的荧光团。手动聚焦于载玻片上各标记物曝光适度的区域，然后使用自动曝光功能为该荧光团设置曝光时间。为确保无偏采样，随机选择图像采集的初始区域，并重点关注管腔上皮边界。

捕获初始视野后，向左或向右移动一个视野以选择后续区域，每次成像之间跳过一个视野。保持管腔上皮边界在视野范围内，至少捕获五个不同的区域，以包含约 10,000 个基质细胞。TSA 单重和多重染色显示自然杀伤细胞（NK 细胞）标记物存在明显的共定位，从而能够鉴定出不同的 NK 细胞群体。

多重检测策略采用波长差异较大的荧光染料，以避免光谱重叠并确保背景清晰，从而确认信号的特异性。首先，对经适当抗体染色的子宫内膜组织切片进行成像。要导入多光谱图像，请在软件界面中导航至“文件”，然后选择“打开图像”。

单击“选择荧光染料”，选择适当的光谱库以分离荧光染料，然后单击“确定”进行确认。使用自发荧光（AF）吸管工具从AF图像中选取具有代表性的组织区域，以分离自发荧光光谱。标记四种细胞表面标志物，并为其分配特定颜色以便识别。

单击“准备图像”或“全部准备”以完成制备。对于组织分割，每种组织类型（包括上皮、间质和空白区域）需手动勾画三到五个区域。根据需要调整区域和参数，以优化训练数据集，提高软件识别组织结构的准确性。

在“分割细胞”部分，选择“细胞核”和“细胞膜”。选择DPI以识别细胞核，并调整强度设置，以在无背景噪声的情况下检测所有细胞核。选择CD16、CD49a和CD56信号以识别细胞膜，并辅助进行细胞核分割。

使用核组分分割功能来区分位置相近的细胞核。在表型分析方案中，采用 CD56、CD49a、CXCR4 和 CD16 标记物进行细胞表型鉴定。使用“添加”按钮将细胞分类为每个标记物的阳性或阴性表达。

在训练过程中，为每种表型至少手动标记五个细胞。配置细胞表型分析后，软件将显示每个细胞表面标志物的表达情况。将数据导出至电子表格以进行进一步分析。

基于 CD49a 和 CXCR4 表达鉴定出的 NK 细胞亚型的新分类策略。