一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

以下实验方案的总体目标是通过同时监测多种细胞表型读数，实现对基因功能的全基因组规模研究。在本示例中，分别使用海肾荧光素酶（Firefly RAN）和西帕利纳荧光素酶（Cipro Dina Luciferase）报告系统来监测P53野生型（P 53 WINT）和KRAS信号通路的活性。这三种报告系统与靶向目标基因的irna共同转染至HCT 116细胞（一种结直肠癌细胞系）中。

随后，在细胞裂解液中检测萤光素酶和香草素荧光素酶的活性，同时检测Cipro DEA荧光素酶这一分泌型酶在培养基中的活性。所得结果表明该检测系统具有良好的可重复性，并能够揭示这三个与癌症相关通路中基因的共有及独特作用。

与现有的微阵列或多色探针等方法相比，该技术的主要优势在于其经济实惠、通用性强，且是一种具有成本效益的分析细胞转录输出的方法。该方法有助于回答癌症研究中的问题，例如分子靶向治疗策略的开发。尽管我们采用的瞬时转染方案在初始投入和筛选设置所需时间方面较为节省，但可能导致孔间信号变异性的增加，这一问题可通过分析报告基因的比值而非直接考察各孔的绝对信号值来克服。开始此实验步骤时，用 PBS 洗涤五块面积为 10 平方厘米、融合度为 80% 至 90% 的 HCT 116 细胞培养板，随后每块板均通过胰酶消化法收集细胞。

加入1毫升胰蛋白酶溶液，随后加入含2% FBS和1%青霉素的10毫升DMEM进行中和。将悬浮细胞转移至50毫升锥形管中，在约130 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升培养基中。

使用细胞计数器计数细胞数量，然后配制细胞浓度为每毫升10^5个细胞的细胞悬液。使用多通道自动液体分配器板保留150毫升细胞悬液用于下一步操作，在96孔细胞培养板中每孔加入100微升，即每孔含10^4个细胞。

在此情况下，细胞悬液应足以用于接种1296个孔板。在准备转染混合物的同时，将接种有细胞的孔板置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37摄氏度下孵育。此处使用的高质量报告基因质粒DNA采用标准MIDI质粒提取试剂盒分离，并稀释至终浓度为1毫克/毫升。

针对每种报告基因，通过混合以下组分制备 100 微升报告基因构建体质粒储备液：30 微升 P53、30 微升 FL、30 微升八倍 X-T-C-F-R-L、6 微升 U-A-S-C-L 以及 4 微升 H₂O。最终获得的 DNA 混合物中，各报告基因质粒的比例为 1:1:1:0.2，总 DNA 浓度为 0.3 毫克/毫升。接下来，准备足量的 RNA-DNA 转染混合物，用于转染 1296 个样品。

将报告基因构建体质粒的储存液 80 微升加入 8 毫升 QIAGEN 转染试剂盒中的 EC 缓冲液中，稀释后得到终浓度为每毫升 3 微克的 DNA 溶液。将 20 微升该 DNA 溶液加入 96 孔 PCR 板的每个孔中。所需 96 孔板的数量取决于待检测的 irna 文库数量。

例如，在本实验中，我们需要使用 4 块 96 孔板进行评估。利用 Biome 自动化液体处理系统，将每种 5 µM 的 siRNA 各 2 µL 转移至含有稀释后 DNA 储液的 PCR 板的相应孔中。接着，向 DNA 与 siRNA 混合板的每个孔中加入 1 µL 增强溶液。

在室温下孵育增强反应5分钟。然后向每个孔中加入3 µL转染试剂，并在室温下继续孵育10分钟。为终止转染复合物的形成，向PCR板的每孔中加入10 µL含有2% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM。

从培养箱中取出含有 HCT 116 细胞的 96 孔板。将 10 微升转染混合物加入到每个含有细胞的 96 孔板的孔中，每项转染实验均设置三个重复孔。相同的混合物将用于另外两个含有细胞的 96 孔板。

将细胞与转染混合物在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育36小时。转染细胞36小时后，荧光素酶活性即可用于检测。

由于本研究采用了多种报告分子，其中一种分泌到培养基中，另外两种在细胞质中表达。因此，将从培养基以及细胞裂解液中分别进行检测，以测定培养物中Cipro Dina荧光素酶或CL活性。培养基复制板。

向白色不透明的96孔板中加入20微升培养基。使用多通道移液器向每孔加入20微升化学发光（CL）检测试剂缓冲液。接着，向每孔加入10微升Cipro Dina荧光素酶和底物，然后使用化学发光仪检测萤火虫荧光素酶和香草荧光素酶的活性；在检测前，必须首先制备细胞裂解液。

将培养板倒置，将培养基弃入水槽中，从而从细胞中移除培养基。将倒置的培养板轻轻在纸巾上轻拍，以去除残留的培养基。向每孔细胞中加入 30 µL 1× 被动裂解缓冲液。

将培养板置于摇床上，室温下以中等速度振荡五分钟。五分钟后，向每孔细胞中加入 20 µL 荧光素酶检测试剂，并立即使用化学发光仪测定荧光素酶活性。接着，加入终止-发光试剂以淬灭荧光素酶活性，然后测定荧光素酶活性。

在进行多重检测之前，分别评估了三种不同筛选平台的稳健性。将指定的结直肠癌细胞系转染八种XTCF PP 53 ta Luke或ALK1荧光素酶编码报告质粒，同时转染靶向WINT、β-Catenin、P53或KAS的siRNA混合物。每种细胞系的通路相关基因型均已标明。

通过相关信号转导通路中这些诱导效应的可重复性，评估了每种筛选平台的可靠性。如这些代表性结果所示，甜菜碱和siRNA对RKO细胞中的八倍XTCF报告基因活性均无影响。相比之下，DLD-1和HCT 116细胞分别存在APC通路缺陷、抑癌蛋白缺失，并表达一种活化的β-catenin形式。

随后研究表明，利用图中所示的siRNA文库，可将这些报告基因联合使用，以同时检测Wnt/β-catenin、P53和KRAS信号转导通路的基因活性。相对荧光素酶活性显示在Y轴上，靶向特定目的基因的siRNA显示在X轴上。例如，靶向β-catenin的siRNA文库可降低Wnt/β-catenin通路活性，而对P53和KRAS通路无明显影响。

在尝试开发多重报告系统时，优化目标细胞系的转染区域和报告信号强度至关重要。