可见光至短波红外波段生物吸收光谱的表征

我们的实验室开发基于光的工具，为孕产妇健康应用提供诊断信息。我们经常使用光谱学技术，因为它能够无创地提供大量与健康相关的信息，例如监测血氧饱和度和血红蛋白浓度，这两项均为妊娠期间需要监测的重要生理参数。颗粒态水中的某些溶剂具有强吸收特性，可能会掩盖目标溶质的信号。

此外，跨越可见光至短波红外（VIS-SWIR）区域的光谱在不同波长范围内的吸收值常存在显著差异，因此我们必须针对不同区域调整实验参数，以获得高信噪比的光谱。由于获取 VIS-SWIR 生物光谱存在困难，已发表的生物吸收光谱数据十分有限，我们旨在简化这一过程。此外，深入理解各生物组分特有的光谱特征，将有助于选择最优波长，从而最大限度地减少黑色素强吸收所引起的皮肤色素干扰。

我们希望本实验方案能够帮助研究人员扩展当前生物吸收体的可见-短波红外（VIS-SWIR）光谱库。这些结果还强调了黑色素在不同波长下对光学器件的影响，可用于设计皮肤色素干扰最小化的系统，例如在短波红外（SWIR）波段的应用。为制备含氧血红蛋白样品，取1.8毫升肝素抗凝全人血，用移液器转移至微量离心管中。

将离心管在9.6g条件下离心10分钟，弃去约850微升上清液，注意不要扰动沉淀。用约850微升氘代水重悬沉淀，再次在9.6g条件下离心10分钟。最后一次离心后，为裂解红细胞，用4.5毫升氘代水重悬红细胞沉淀。

如果沉淀物附着在管壁上，可用部分氘代水冲洗以使其松动。使用钝头针头和注射器，将裂解后的血液溶液从管中移出。然后将钝头针头从注射器上取下，并将其丢弃于生物危害锐器容器中。

接下来，将一个0.22微米的注射器滤器连接到注射器上，并将溶液过滤至光程为10毫米、体积为3.5毫升的玻璃或石英比色皿中。用气密性塞子密封比色皿，以防止污染。再用Parafilm封口膜包裹塞子，确保完全密封。

通过使用与样品相同光程、长度和体积的洁净比色皿，并装入重水，来制备用于基线和参考测量的对照样品。为制备脱氧血红蛋白样品，向比色皿中的血液溶液加入连二亚硫酸钠。用气密性塞子密封比色皿，并在塞子周围包裹Parafilm膜，以确保密封性。

轻轻左右倾斜比色皿，直至连二亚硫酸钠完全溶解。观察血液溶液颜色由红色变为更深的紫红色。首先，打开光谱仪的光源和检测器，让系统预热 5 至 20 分钟。

使用Kimwipe纸巾蘸乙醇清洗比色皿。对于双光束分光光度计，将装有重水的比色皿作为参比溶液分别放入样品室和参比室中。根据待测光谱区域选择合适的波长范围和检测器。

使用默认参数获取参考测量值。然后，将样品室中的比色皿替换为含有氧合血红蛋白的比色皿。切换至实时模式，以便在调整测量参数时连续观察吸光度。

从默认的光谱仪参数开始，调整每次测量的读取次数和带宽，以获得一条无饱和现象且质量良好的吸收光谱。如果调整入射光功率、带宽、曝光时间以及每次测量的读取次数仍无法获得高信噪比的光谱，则应改变样品浓度，或将参比比色皿置于样品室或参比室中，或调整样品和参比的光程长度，以获得高信噪比的光谱。一旦确定了适合样品的最优参数设置，应记录下每一条所获取光谱对应的仪器设置。

使用优化后的设置，将参比溶液分别放入参比室和样品室，重新测量以获得优化的参比测量值。接着，将样品室中的参比比色皿替换为含氧合血红蛋白样品的比色皿，进行优化的样品测量。分别保存参比和样品的测量结果。

使用以下公式，将参考测量值视为 I₀，样品测量值视为 I，计算吸光度 A。进行后处理时，打开 MATLAB 等数据分析软件，载入从光谱不同区域获取的吸光度测量数据。对某一光谱区域应用乘法因子，以拼接因样品浓度或光程长度不同而获得的各个光谱区域。氧合血红蛋白光谱与 Prahl 发表的光谱表现出高度一致性，在可见光区于 415 纳米处有明显的吸收峰，并在 540 至 575 纳米范围内呈现双峰结构，同时在近红外区 800 至 1,100 纳米之间具有宽吸收特征。

在短波红外区域，氧合血红蛋白光谱显示出较低的吸收，可能是由于残留的水分含量所致。脱氧血红蛋白光谱与Prahl的光谱表现出强相关性，在430纳米、560纳米和760纳米处有明显的峰，在约1,200纳米以及1,400至1,600纳米之间有较小的峰。