单层保护金纳米颗粒薄膜的合成、组装及表征用于蛋白质单层电化学研究

以下实验的总体目标是合成经烷基稳定化的金纳米颗粒，即单层保护簇（MPCs），并将这些材料组装成薄膜结构，用作偶氮蛋白单分子层电化学的吸附界面。该过程首先通过有机配体保护金胶体，形成被烷基硫醇膜包围的金纳米颗粒。随后，将MPCs锚定在金和玻璃基底上，并交联形成多层共价连接的薄膜，通过光学和电化学测量以及横截面显微技术监测薄膜的生长过程。

然后，电子传递蛋白azurin在界面处吸附，并对蛋白单分子层进行循环伏安法电化学检测。结果表明，通过该方法构建的MPC薄膜界面能够基于MPC薄膜实现更优化的吸附蛋白电化学分析，提供更均一的吸附界面以及不依赖于传统距离效应的快速电子传递动力学。该技术相较于传统蛋白电化学的主要优势在于，采用纳米粒子薄膜修饰的电极可提供一种吸附界面，从而在循环伏安法测定中表现出更理想的电化学行为。

该方法的可视化演示至关重要，因为合成过程包含重要的视觉提示，而薄膜的构建与表征涉及多个复杂的步骤和分析技术。NPC薄膜可通过浸渍循环法在经修饰的金电极或玻璃载片上组装，该方法交替使用MPC层和双功能连接分子。随后，可通过电化学或光学手段对这些层进行追踪，以达到所需的薄膜厚度。

在通风良好的通风橱中合成金簇时，首先将 1.1 克四正丁基溴化铵溶解于 30 毫升甲苯中，再将 0.38 克硼氢化钠溶解于约 20 毫升 18 兆欧超纯水中，并置于冰上冷却至少 30 分钟。接下来，使用额外的 5 毫升超纯水，将氯金酸水溶液定量转移至四正丁基溴化铵的甲苯溶液中。为将水相中的金溶液转移至非水相中，需轻轻盖紧容器并剧烈搅拌 30 分钟。

因此，将棕橙色的水相和澄清的非水相充分混合。将澄清的水相和棕橙色的非水相一同转移至分液漏斗中。弃去水相层，将非水相层倾入洁净的烧瓶中。

向含有非水溶液的四氯氢或盐中加入C六和二比一的比例。搅拌30分钟，直至观察到颜色由红橙色变为浅黄色、近乎无色的溶液，表明生成了金一聚合物。将反应混合物转移至隔热冰浴中，在搅拌条件下冷却至0摄氏度，持续至少30分钟；随后定量且迅速地将预冷的硼氢化钠溶液加入反应混合物中，以在 thighs 存在下将金一还原为金属金。

加入后，将立即形成深黑色的单层保护金簇（MPCs）溶液。将反应液在0°C下搅拌过夜。次日，将反应混合物转移至分液漏斗中。

将水相弃入废液杯中并进行旋转蒸发。将非水相甲苯层蒸至接近完全干燥，烧瓶中残留浓稠的黑色油泥。加入乙腈使MPCs沉淀，并将溶液在带有橡胶接头和侧臂烧瓶的中等孔隙度玻璃砂芯漏斗装置中静置过夜，使用水流抽气泵进行抽滤。

通过真空过滤收集MPCs，并用大量乙腈冲洗。电化学组装三明治电池后，在0.1摩尔硫酸和0.01摩尔氯化钾溶液中，以100毫伏每秒的扫描速率，在0.2至0.9伏、0.2至1.2伏和0.2至1.35伏的电位窗口内进行循环伏安法（CV）以清洁金基底。在标准条件下对清洁后的裸金基底进行循环伏安法（CV）测量双电层充电电流，标准条件包括在磷酸钾缓冲液（KPB）中，相对于银/氯化银参比电极，电位窗口为0.1至0.4伏，扫描速率为100毫伏每秒。

弃去缓冲液，并用超纯水和乙醇各过量冲洗两次。将清洗后的金基底浸入约300微升的5毫摩尔C6乙醇溶液中，静置过夜，以形成有序的C6自组装单分子膜。从样品池中弃去C6溶液，并用乙醇和超纯水各过量冲洗两次。

在标准条件下测量自组装单分子膜（SAM）的充电电流。弃去磷酸钾缓冲液（KPB），用超纯水和乙醇分别彻底冲洗两次。充电电流应显著降低。

与裸金测量结果相比，将自组装单分子膜（SAM）修饰的金基底暴露于约300微升乙醇中的5毫摩尔NDT溶液中，静置一小时，使NDT连接分子在C6 SAM中充分分散。弃去NDT溶液，用乙醇和超纯水彻底冲洗两次，再用二氯甲烷冲洗一次。将金基底置于二氯甲烷中的MPC溶液中，并通过氮气缓慢鼓泡搅拌一小时。

这是薄膜组装中的锚定MPC层。弃去MPC溶液，再依次用二氯甲烷、超纯水和KPB冲洗。在标准条件下测量MPC层的充电电流。

弃去KPB溶液，并用超纯水和DIAM甲烷大量冲洗。将金基底暴露于约300微升的NDT溶液中，该溶液为五毫摩尔浓度的NDT溶于DIAM甲烷中，通过缓慢通入氮气搅拌反应20分钟。弃去NDT溶液，并用DIAM甲烷彻底冲洗，以沉积第二层MPC。

将薄膜组件重新浸入DIAM甲烷的MPC溶液中，缓慢通入氮气鼓泡搅拌，静置一小时后再进行冲洗。随后在标准条件下再次测量MPC层的充电电流，并使用相同程序再次冲洗。如有需要，可继续沉积额外的MPC层。

网络化 MPC 薄膜制备完成后，用 KPB 冲洗经薄膜修饰的基底，以将 AZ 蛋白吸附到 MPC 薄膜组装体上。将约 150 微升浓度为 5 至 10 微摩尔的 AZ 溶液（溶于 KPB）注入 E chem 三明治池中，盖紧后于冰箱中静置至少一小时。待 ECM 池恢复至室温后，用 KPB 充分冲洗，重新注入 KPB，并用氮气鼓泡 10 分钟。

在 -0.25 伏至 0.25 伏的电位窗口内进行单层电化学研究，如循环伏安法（CV）。在 KPB 中以 100 毫伏/秒的速率扫描，用去离子甲烷冲洗经 3M PT MS 修饰的玻片，然后将其置于含去离子甲烷的 MPC 溶液中，在摇床上低速振荡条件下孵育一小时。通过将 MPC 锚定在硅烷的 ME 丙硫醇末端基团上，完成薄膜组装的第一层 MPC 构建。

用二氯甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气吹干，然后在将载玻片浸泡于二氯甲烷中的NDT溶液后，对载玻片进行紫外-可见光谱测定。将载玻片置于MPC溶液中，于低速摇床上振荡反应一小时。至此完成薄膜组装的第二层MPC修饰。

用二甲基甲烷彻底冲洗载玻片，用氮气吹干，并对载玻片进行紫外-可见光谱扫描。随着更多的MPC层被吸附到薄膜组装体上，整个光谱范围内的吸光度应逐渐增加。将组装在经3M PT MS修饰的玻璃载玻片上的MPC薄膜转移至标准显微镜载玻片上。

制备嵌入八-12环氧树脂，并使其增稠至少12小时。用环氧树脂填充一个梁式胶囊，然后将其倒置在MPC薄膜样品上。对胶囊施加压力，使气泡上升至胶囊顶部，从而在环氧树脂与MPC薄膜样品之间形成密封。

在60摄氏度下使其聚合至少18小时，然后将封固的载玻片冷却至室温。将封固的载玻片置于铸铝加热板上，在200摄氏度下加热20秒，以促进将带有附着MPC的块体从快速胶片上分离。使用珠宝锯将含有薄膜的样品从光束胶囊块上切下，并将移除的部分放入硅胶平模中，使MPC薄膜面朝上，面向硅胶内部。

在室温下将环氧树脂填充至硅胶模具中，并在60摄氏度下使其聚合至少18小时。随后将样品冷却至室温。使用Leica UCT超薄切片机和金刚石刀切割60至80纳米的薄片，切片方向垂直于刀刃边缘。将切下的薄片置于400目铜网的form VAR碳支持膜上，并对所示MPC薄膜组件的横截面进行透射电子显微镜（TEM）成像。

以下是MPC薄膜生长过程中双层充电电流监测的结果，共进行了五次浸渍循环，交替暴露于MPC和NDT溶液中。随着每次浸渍循环的进行，充电电流系统性增加，表明MPC层在薄膜上不断累积。

以下是在4.4毫摩尔磷酸钾缓冲液中，采用−0.25至+0.25伏电压范围、以100毫伏/秒扫描速率测得的典型AZ加成MPC薄膜组装循环伏安曲线（Graham法）。此处展示了在3M PT MS修饰的载玻片上，通过UV-vis光谱监测二醇连接MPC薄膜生长过程的代表性结果。一个浸渍循环包括将载玻片依次暴露于NDT交联剂溶液，随后暴露于MPC溶液。

每次后续浸渍均会导致薄膜厚度增加，同时吸光度相应升高。该图展示了通过DIA连接的MPC薄膜组装体的透射电子显微镜截面图像分析。插图显示了用于薄膜组装体透射电镜分析的六甲醇功能化MPC的典型透射电镜图像。

使用 Image J 测定 MPC 的平均金核直径约为 2 纳米。观看本视频后，您应充分了解如何合成、表征和组装 MPC 金纳米薄膜，此类薄膜可作为氧化还原蛋白吸附及后续电化学分析的界面。通过调整 MPC 的合成方法以及颗粒内部的连接机制，该薄膜组装过程可轻松适应多种不同类型蛋白质的吸附需求。

尽管该方法可为蛋白质在经修饰的合成平台上的电化学吸附提供见解，但也可应用于电子传递模型系统、生物传感方案以及合成生物相容性材料的开发。