基于流式细胞术分离及在胰腺癌小鼠模型中对肿瘤浸润淋巴细胞进行治疗效果评估

我们致力于开发一种在胰腺癌模型中分离和过继性转移肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的方法。我们试图回答TIL亚群是否能在体内有效靶向并杀伤胰腺肿瘤，以及如何优化T细胞以用于未来的临床试验。近年来，过继性细胞治疗领域取得了进展，包括改进TIL的分离与表达技术，轻度修饰TIL以增强其靶向能力，以及将TIL治疗与其他免疫疗法（如检查点抑制剂或靶向治疗）联合使用，以提高抗肿瘤疗效。

我们已建立一种从胰腺癌小鼠模型中分离和扩增肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的稳健方法。我们证实了过继转移的肿瘤反应性T细胞具有增强的抗肿瘤效果。与其它特异性较低的方法相比，本方案通过实现肿瘤特异性TILs的分离与筛选，为过继性细胞治疗提供了更具靶向性的策略。

此外，该方法还利用生物发光成像技术对肿瘤进行无创监测。我们的研究结果将通过提供一种标准化的临床前模型，用于评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗在胰腺癌中的疗效，并优化T细胞亚群的治疗参数，从而推动该领域的发展。为在小鼠体内建立原位胰腺肿瘤模型，需制备KPC-Luciferase细胞悬液，将KPC-Luciferase细胞系在37摄氏度条件下消化1分钟。

消化后，加入 PBS，转移细胞，然后离心细胞悬液。计数细胞，并将其重悬于含有 30% 基底膜基质的 PBS 中，细胞浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升。将麻醉小鼠置于手术平台上。

在左侧腹部做0.5至1厘米的切口后，用镊子夹住脾脏并暴露胰腺。准备好KPC-Luciferase细胞与基底膜基质的混合物后，使用29号针头将含有50,000个细胞的50微升细胞悬液注射到胰腺中。然后将胰腺放回腹腔内。

依次缝合腹膜和皮肤。将小鼠置于保温垫上，直至其完全苏醒。术后7天，向小鼠腹腔注射60微升D-荧光素钾盐溶液，用于活体成像。

麻醉后，将小鼠置于活体成像系统中进行生物发光检测。成像结束后，将小鼠从系统中取出，并使其自然恢复清醒。首先，将已实施安乐死的供体小鼠放置于手术平台上。

用75%乙醇对整个身体进行消毒。在无菌操作台中，使用剪刀和镊子打开腹腔。取出肿瘤并将其置于冰上的PBS中。

使用游标卡尺测量肿瘤大小，然后根据屏幕上的公式计算肿瘤体积。在使用胶原酶、Dispase II 和 DNAse I 配制 RPMI 1640 中的 1× 消化液后，每孔加入 1 至 2 毫升该溶液至 12 孔板中。

使用剪刀将肿瘤组织剪成小块。将肿瘤组织块转移至12孔板的每个孔中，在37摄氏度、70转/分钟振荡条件下消化30分钟。消化结束后，加入1至2毫升含10%胎牛血清的培养基，终止消化反应，并将细胞悬液转移至收集管中。

用 PBS 清洗 12 孔板的孔两次，以收集残留的细胞。将细胞悬液通过 70 微米细胞筛网过滤，使用注射器活塞的平端切碎并研磨组织碎片，以释放单个细胞。在 4°C 条件下以 400 ×g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 5% 牛血清白蛋白中，用于流式细胞术染色。

首先，将来自荷瘤小鼠的分离细胞与来自非荷瘤小鼠的脾脏或外周血单个核细胞置于工作平台。使用FC阻断剂和流式抗体以1:100的稀释比例对细胞进行染色。将试管置于冰上避光孵育30分钟。

孵育后，通过离心用 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于含 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中。在流式细胞仪上分选 CD45+CD3+ 细胞时，根据 FSC-A 和 SSC-A 设门圈选活细胞，得到门 P1；接着，根据 FSC-A 和 FSC-H 从 P1 中圈选单细胞，得到门 P2；最后，利用 CD45 和 CD3 设门，从 P2 中分选 CD45+CD3+ 细胞，并将分选出的细胞收集至收集管中。

在4°C条件下，以400 × g离心力离心分选后的CD45+CD3+细胞5分钟。用小鼠血清将细胞重悬至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升，并置于冰上。将荷瘤受体小鼠放置于手术平台上。

使用29号1/2英寸胰岛素注射器，将分选后的免疫细胞进行腹腔注射。随后，连续三天腹腔注射白细胞介素-2。