通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数

基于微流控技术，从正常血细胞中分离和表征循环肿瘤细胞（CTCs）无需使用特定的CTC生物标志物，且与细胞培养兼容。该方案可实现高效率的CTC提取，并通过评估恶性细胞形态学特征，对CTCs进行深入的细胞学分析。CTCs表达PD-L1在肺癌管理中具有预测价值。

通过本检测方法提高其检出率，从长远来看可能促进对患者的更好管理。该方案的其他应用包括使用FISH检测基因异常，对循环肿瘤细胞（CTCs）进行转录组分析，以及从孕妇体内分离胎儿来源的细胞。本次操作演示将由本实验室的技术员Julie Balandier进行。

在进行循环肿瘤细胞的预分析富集时，首先将7.5毫升血液采集至含钾EDTA的采血管中，并保持样本轻柔振荡，以避免细胞沉降和凝血。采集后六小时内，在生物安全柜中使用血清移液管将最多7.5毫升全血转移至新的50毫升离心管中，在室温下以1600 × g离心10分钟。离心结束后，使用移液管小心收集血浆组分，避免扰动白膜层，并用等体积的PBS将血浆稀释至最多7.5毫升。

接下来，向血液样本中小心加入红细胞裂解缓冲液，终体积为 30 毫升，轻轻倒置采血管 3 次，然后将试管置于室温下孵育 10 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，小心弃去上清液，仅保留最后 4 至 5 毫升。使用带滤膜的微量移液器移除剩余的上清液，并用带滤膜吸头的 P1000 移液器沿管壁缓慢加入 1 毫升重悬缓冲液。

为避免产生气泡，需轻柔吹打重悬细胞沉淀，直至样品均匀。当沉淀完全重悬后，沿管壁加入额外的三毫升重悬缓冲液，避免引入气泡，并再次轻柔混匀细胞。对于螺旋微流控装置循环肿瘤细胞富集，首先将新的螺旋微流控芯片装载到装置上，并在进样口和出样口各装入一个空的50毫升离心管。

点击“启动”按钮，对螺旋微流控装置进行预处理，持续三分钟。在循环结束时，移除输入和输出管路。将重悬的血液样本加入输入端口，并将一个透明的15毫升锥形管放入输出端口。

然后点击运行，选择程序三以启动31分钟的循环肿瘤细胞富集程序。循环结束后，将输出管转移至离心机，使用5毫升血清移液管移除上清液，仅保留最后2毫升。随后使用微量移液器移除上清液，仅保留最后100微升。

进行免疫荧光染色时，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将富集后的样品稀释至每100微升0.2%抗结合溶液中含有1×10⁵个细胞的浓度。接着，用含有50微升抗结合溶液的棉签润湿样品室的边缘轮廓，将一张多聚赖氨酸包被的玻片放入样品室中。关闭样品室，用移液器吸取并吹打三次，使微量移液器吸头表面被结合溶液充分润湿，然后将样品在剩余的100微升上清液中重悬。

将细胞悬液转移至样品室中，使用专用离心机以400转/分钟的速度在低加速度条件下离心4分钟。离心结束后，在沉积区域周围放置硅胶隔离器，将载玻片置于生物安全柜中干燥2分钟，随后加入100 µL 4%多聚甲醛，在室温下固定10分钟，接着每次用200 µL PBS洗涤2分钟，共洗涤3次，每次均在室温下进行。最后一次洗涤后，在室温下用封闭剂孵育30分钟以阻断非特异性结合，随后加入100 µL目标抗体溶液进行标记。

将标记好的载玻片置于含有吸水纸的 100 × 15 毫米培养皿中，吸水纸上加入 2 毫升无菌水使其湿润，将培养皿盖好后于 4 °C 避光过夜。次日清晨，用 PBS 如所示方法清洗样本三次，然后加入 10 µL 适当的封片液，并用盖玻片封片。随后用透明指甲油密封盖玻片。

为了对细胞离心涂片样本进行成像，将玻片装载到配备X Y电动载物台的直立荧光显微镜上，根据抗体标记所用的荧光染料选择20倍物镜及相应的荧光通道。打开汞灯，并将显微镜及相关软件设置为半自动拍摄模式。当汞灯预热完成后，在采集菜单中定义四个荧光通道，设定曝光时间，并确定需要扫描的图像区域（tiles）。

单击图块，选择高级实验，并定义扫描区域。然后在屏幕上调整焦距，单击开始实验。实验结束后，导出每个通道的 TIF 文件，并为文件命名，具体应包含样品名称、重复次数、染料名称以及子图块数量。

进行图像分析时，从布罗德研究所网站打开图像分析软件，点击文件、从文件加载流程、四通道CTC分析。将文件拖入文件列表，并更新元数据以按图像块对文件进行分组。然后点击分析图像，以打开与测量强度参数对应的电子表格文件。

若未采用优化的去污染方案，在富集的 A549 细胞系组织培养中，仅 24 小时后即可观察到严重的细菌污染，导致真核细胞死亡及细胞形态学改变。相比之下，在实施清洁方案后，于组织培养 10 小时并更换培养基后，可在二维培养条件下、三维培养条件下以及患者样本中获得存活的 A549 细胞。通过液相免疫荧光染色检测或在多聚赖氨酸包被的载玻片上进行细胞离心涂片免疫荧光染色检测，可观察到两种检测方法在计数细胞核数量上的明显差异。

如果不进行细胞离心步骤，由于非细胞离心制备的细胞轮廓模糊，很难将白细胞与肿瘤细胞区分开来。在此可观察到不同患者样本中的各种代表性结果，特别是白细胞的残留数量被确定为具有高度变异性，并依赖于全血样本。所获得的循环肿瘤细胞亚群也表现出较高的变异性。

图像分析软件可识别细胞涂片上的每个细胞，并能够追踪细胞，必要时可手动确认结果。事实上，初步分析表明，人工计数与图像分析软件计数结果之间具有良好的一致性。自制的湿润培养皿装置对蛋白质-抗体杂交至关重要，因为该装置必须在整个孵育期间保持足够的湿度。