基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离
2025年2月28日
THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。
我的研究工作重点在于阐明使巨噬细胞对HIV（导致艾滋病大流行的病毒）感染产生抵抗作用的机制。特别是，我们关注一种名为HT-1的酶的作用，该酶可降解NTPs（病毒基因组的基本组成单位）。但这种酶还具有其他功能，我们正致力于阐明这些功能。
我们建立了一种对THP1细胞进行基因工程改造的实验方案。这些细胞是研究人类巨噬细胞的成熟替代模型，例如可用于研究HIV-1的复制过程。
这些细胞难以转染，从而难以操控其蛋白质含量。因此，我们建立了利用 CRISPR-Cas9 技术操控其基因组的方法，从单导向 RNA（sgRNA）的设计到多克隆和单克隆细胞群体的验证。
本实验方案旨在实现对THP1细胞中目的基因的高效编辑，通过将预先组装的Cas9核酸酶与RNA形成的核糖核蛋白复合物电转染至细胞内。该方法中，Cas9的活性在时间上受到限制，从而降低使用慢病毒载体时常出现的脱靶效应风险。
在此情况下，Cas9 的表达确实会延长作用时间，因此可能对细胞造成损伤。开始实验时，向 24 孔培养板的每孔中加入 500 µL 不含抗生素的 RPMI 1640 培养基，该培养基需补充 20% 经热灭活并过滤的 FBS。将培养板置于湿润培养箱中孵育过夜。
将干燥的单链向导RNA（sgRNA）重悬，配制成终浓度为100微摩尔（µM）的溶液，需按每1纳摩尔（nmol）sgRNA加入10微升（µL）TE缓冲液。涡旋混匀30秒，于4摄氏度（°C）孵育过夜，以确保完全重悬。次日，为配制30微摩尔（µM）的工作浓度sgRNA溶液，首先用移液器轻轻混匀100微摩尔（µM）的储存液，然后用无核酸酶水稀释储存液。
涡旋混匀溶液30秒，在室温下孵育5分钟。取三种30 µM sgRNA工作溶液各1 µL，以及20 µM Cas9溶液0.5 µL，加入3.5 µL重悬缓冲液R中稀释，以1:9的摩尔比组装Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物。短暂涡旋混匀，于室温孵育5分钟。
制备未编辑的对照组时，向6.5微升重悬缓冲液R中加入0.5微升20微摩尔的Cas9溶液，短暂涡旋混匀，在室温下孵育5分钟。向样品中加入5微升重悬缓冲液R，使每种电穿孔条件下的终体积达到12微升。在细胞计数后，收集相当于0.2×10⁶个THP-1细胞的体积，于20摄氏度下以336×g离心5分钟，用移液器吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500微升磷酸盐缓冲液（PBS）中。再次离心后，将细胞沉淀重悬于12微升核糖核蛋白溶液中。
为建立电穿孔系统，将移液工作站置于生物安全柜内，在安全柜中放置一根电穿孔管，并向电穿孔管中加入3 mL电穿孔试剂盒中的缓冲液E。打开电穿孔仪，通过触摸屏设置电穿孔参数：电压为1,500伏特，持续时间为10毫秒。
然后数到三。将电穿孔移液枪装上枪头，吸取10 µL核糖核蛋白THP-1溶液。将移液枪插入电穿孔管中，按下电穿孔仪屏幕上的启动按钮。
等待“complete”消息出现后，将移液器从管中取出。将THP-1细胞转移至预热的24孔培养板的一个孔中，并轻轻混匀样品。将培养板放回加湿的培养箱中，静置培养细胞72小时，期间避免扰动。
电穿孔并计数细胞后，将相当于0.1 × 10⁶个THP-1细胞的体积转移至1.5毫升离心管中。在20°C下以336 × g离心5分钟，吸除上清液，然后将沉淀重悬于500 µL PBS中。再次离心细胞，尽可能吸除上清液，注意勿扰动沉淀，随后迅速冷冻沉淀。
基因组DNA提取时，用50微升DNA提取液重悬沉淀。充分匀浆后，将全部液体转移至0.2毫升PCR管中。涡旋振荡管内液体，然后短暂离心，离心时间为3秒。
将离心管放入热循环仪中，于65摄氏度加热15分钟，随后在98摄氏度加热10分钟。接下来，用90微升超纯水稀释提取的DNA，涡旋混匀，并在5000G下短暂离心3秒。用超纯水将PCR引物稀释至终浓度为10微摩尔。
在0.2毫升PCR管中配制PCR反应体系。将PCR管放入热循环仪中，并按照指定参数运行程序。针对新0.2毫升PCR管中的多克隆编辑细胞群体进行操作。
取17.5微升PCR扩增产物与2微升E缓冲液2混合，终体积为19.5微升。充分涡旋混匀后短暂离心。作为替代方案，若需筛选单细胞克隆，可将编辑细胞与未编辑对照细胞的PCR产物按1:1比例混合。为形成异源双链，将反应管放入热循环仪中，并运行指定程序。
异源双链形成后，向管中加入0.5微升T7内切酶1溶液，在37摄氏度孵育30分钟。为准备凝胶电泳样品，取5微升T7内切酶1消化产物或未消化的PCR产物，加入5微升水和2微升6×DNA上样缓冲液，混匀后将样品及分子量标记物加入凝胶孔中，在80伏电压下电泳运行45分钟。CRISPR Cas9介导的EGFP位点基因编辑导致GFP阳性细胞数量急剧下降，电穿孔后第7天减少幅度超过90%。
电穿孔后第三天，由于电穿孔引起的应激反应，细胞数量减少了一半，但在完全RPMI培养基中培养至第七天时完全恢复。T7核酸内切酶1检测和琼脂糖凝胶电泳显示，经编辑的细胞中约有75个碱基对的片段缺失，证实了CRISPR对EGFP靶位点的成功编辑。
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概述
本文介绍了一种对人巨噬细胞模型 THP-1 细胞进行基因工程改造的实验方案，用于研究其对 HIV 感染的抵抗能力。重点在于阐明酶 HT-1 在降解病毒基因组组分中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 传染病
背景
- THP-1 细胞被广泛用作人巨噬细胞的替代模型。
- 理解巨噬细胞对 HIV 的抵抗机制对于艾滋病研究至关重要。
- HT-1 酶具有多种影响病毒复制的活性。
- CRISPR-Cas9 技术可实现精确的遗传修饰。
研究目的
- 建立一种高效遗传改造 THP-1 细胞的实验方案。
- 研究巨噬细胞中 HIV 抵抗的机制。
- 产生可重复的表型数据，以供进一步研究使用。
使用方法
- 基于CRISPR-Cas9的THP-1细胞基因工程。
- 单细胞克隆分离技术。
- 基因工程细胞的表型分析。
- 与HIV抗性相关的酶活性研究。
主要结果
- 利用 CRISPR-Cas9 成功对 THP-1 细胞进行基因改造。
- 分离单细胞克隆以进行深入研究。
- 揭示 HT-1 在抗 HIV 中的作用机制。
- 建立可重复的实验方案，为后续研究奠定基础。
结论
- 该方案的建立有助于深化巨噬细胞生物学的研究。
- 阐明HT-1的功能可能为开发新的治疗策略提供方向。
- THP-1细胞仍是HIV研究中重要的模型系统。
常见问题
行业应用价值
高效的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除技术，可在与疾病相关的功能性人源髓系模型中，高可信度地探究免疫相关机制。该工作流程可支持宿主-病原体相互作用研究中的预测性靶点验证和机制性风险排除，直接推动早期发现与转化研究进程。高编辑效率结合单细胞克隆分离，可简化项目筛选流程，加速免疫学相关研发中的功能基因组学研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在 THP-1 细胞中实现基因的稳健功能性敲除，用于机制性假设验证。
- 通过阐明基因在类似巨噬细胞环境中的功能，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于提高在免疫和感染性疾病项目中靶点选择的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游表型分析制备经过验证的单克隆和多克隆基因敲除细胞体系。
- 通过T7核酸内切酶I检测和ICE分析提供可重复、定量的检测结果。
- 可在标准化的细胞背景下实现基因功能和化合物效应的规模化筛选。
转化与临床前研究
- 将工程化 THP-1 模型与疾病相关的巨噬细胞生物学特性对齐，以实现转化研究的连续性。
- 支持对宿主-病原体相互作用中涉及的免疫靶点进行功能验证。
- 通过在类人系统中确认靶点结合，降低后期生物学失败的风险。
流程与工作流整合
这种基于电穿孔的CRISPR工作流程整合了从早期发现到先导分子鉴定以及免疫学和传染病研究管线中的临床前验证全过程。
- 发现生物学：在 THP-1 细胞中提供高效的基因敲除，用于基于假设的通路分析。
- 筛选：提供可重复、定量的基因敲除模型，用于检测方法开发和化合物谱型分析。
- 分析：提供经过验证的插入缺失（indel）定量和蛋白耗竭指标，用于比较研究。
- 转化研究：利用与疾病相关的细胞系统，将体外研究结果与临床前模型相衔接。
- 企业级复用：建立标准化、可扩展的实验流程，可在免疫靶点项目组合中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶点验证中预测的可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：在具有挑战性的细胞系中实现高效的基因编辑和良好的可重复性。
- 战略价值：加快早期项目中“推进/终止”决策进程，提升资金使用效率。
- 组合影响：支持对免疫相关及传染病靶点进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备CRISPR设计、电穿孔和单细胞克隆技术方面的专业知识。
- 需要能够使用电穿孔仪器及分子验证工具（例如T7检测、Sanger测序）。
- 要求跨团队标准化操作，以确保基因敲除的可重复性及验证可靠性。
- 根据编辑效率和细胞存活率，可能需要针对其他细胞类型或基因靶点进行优化调整。
- 必须监测编辑效率和细胞回收率，以确保后续应用的可靠性。
