利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

慢性关节疾病中的软骨修复需要先进的细胞疗法，以有效再生受损组织。本方案提供了一种将诱导性多能干细胞定向分化为软骨细胞类球体的逐步操作方法，可支持组织工程与细胞治疗的应用。慢性关节疾病中的软骨修复需要先进的细胞疗法，以充分再生受损组织。

本方案提供了一种将诱导性多能干细胞分化为基于软骨细胞的球体的逐步方法，可支持组织工程和细胞治疗应用。主要挑战包括：最小化iPSC来源细胞中I型胶原的表达以防止纤维软骨形成，建立促进成熟透明软骨形成的条件，改进三维培养方法以提高球体稳定性，以及开发可扩展的方法以生产临床规模的细胞材料。该方案的优势在于使用iPSC作为软骨细胞的替代来源，能够在无需侵入性操作的情况下实现规模化生产。

通过三维培养，可更好地维持软骨细胞表型，并模拟天然软骨的发育过程，从而获得高度表达软骨特异性标志物、且与天然软骨细胞高度相似的细胞。开发有效方法以增强诱导性多能干细胞来源软骨细胞的成熟度和功能，确保其在体内的长期稳定性，构建纤维化的三维培养材料，并建立适用于临床应用的细胞材料规模化生产体系。首先，将剪刀置于121摄氏度、15磅/平方英寸压力的高压灭菌器中灭菌30分钟。

剪刀干燥后，将离心管切成高度为七到八毫米的环状。现在使用适当的破碎工具将低吸附性、未处理或微生物用培养皿破碎成小碎片。在通风橱内，将约一克塑料颗粒溶于10毫升氯仿中，过夜溶解。

验证液态塑料溶液的黏度，以确保其适合移液操作。如果溶液过稀，可加入一至三克额外的塑料颗粒。如果溶液过稠，则用约五毫升氯仿进行稀释。

在60毫米的培养皿中央放置一个高压灭菌塑料环。然后在环内加入液态塑料，形成一个塑料凸起。将培养皿在超净工作台中敞口干燥2至3小时。

干燥后，将培养皿暴露于紫外线下照射20至30分钟。首先，取含有塑料凸点的改良型培养皿。软骨组织收获后两天，使用60毫米培养皿在Hank's溶液中清洗软骨组织块。

然后使用高压灭菌的剪刀将软骨切成直径约一到两毫米的碎片。将软骨碎片转移至一个15毫升的离心管中，并在DMEM中加入0.01%的II型胶原酶溶液，在旋转摇床培养箱中消化8至12小时。消化完成后，向含有软骨碎片的离心管中加入DMEM，并在300 ×g条件下离心10分钟。

弃去洗涤液后，将组织碎片重悬于软骨细胞培养基中，接种至预先用0.1%明胶溶液包被的贴壁T25培养瓶中，并进行培养。接着，将诱导性多能干细胞培养于预先用含细胞外蛋白的基质包被的六孔板中。为启动向软骨细胞谱系的分化，在前两天将iPSCs置于培养基A中培养。

第3天，将培养基A更换为不含CHIR-99021和rho-激酶抑制剂的溶液，其余成分保持不变。第10天，将软骨细胞样细胞转移至促进软骨生成的培养基B中，随后在700瓦微波炉中加热1.5%琼脂糖约60至90秒使其融化。待其完全液化后，向96孔细胞悬浮培养板的每孔中加入75 µL琼脂糖溶液，并在室温下静置使其凝固。

接下来，向每个孔中加入 150 µL DMEM，并将培养板置于二氧化碳培养箱中孵育至少 12 小时。在第 12 天，观察与雄核发育相关的表型变化，以确定是否进行类球体诱导。当细胞融合度达到 80% 时，使用 0.05% 胰蛋白酶溶液将细胞从培养板上消化下来。

加入等体积含10% FBS的DMEM后，将细胞转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心5分钟。用1毫升培养基B重悬细胞，并将其转移至经0.1%明胶溶液预包被的75平方厘米细胞培养瓶中。当细胞以单层状态生长至80%融合度时，用胰蛋白酶再次消化并以培养基B重悬。随后将细胞以每孔10万个细胞的密度接种于经1.5%琼脂糖包被的96孔板中，每孔加入150微升培养基B。将细胞孵育至少1天，最多3天，直至形成球状体。

然后使用剪去末端的1毫升移液枪头将类球体从孔中转移至15毫升离心管中。让类球体静置2至3分钟，随后吸去上清液。接着将类球体浸入刚解冻且未经稀释、已在4摄氏度平衡的基底膜基质溶液中。

30分钟后，以100 ×g离心1分钟收集类球体。最后将类球体转移至已准备好的微型生物反应器中，并加入6 mL的B培养基。将微型生物反应器放入二氧化碳培养箱中。经过19天的分化后，99%的细胞表达了软骨形成标志物聚集蛋白聚糖（aggrecan）、I型胶原、II型胶原和SOX9。

高质量的软骨球被定义为在分化第30天通过基因表达分析评估，其软骨细胞基因标志物的表达水平至少达到90%至95%。成熟的球状体表现出一致的形态发生，经过两个月后生长至典型直径为一到两毫米，较大的球状体则显示出具有空腔或坏死的中央区域。