基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体
2019年11月7日
我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。
该技术可利用“芯片实验室-光盘”（lab-on-a-CD）平台，从单一或多种细胞类型生成细胞球体，这是一种用于快速生成球体的前沿系统。该技术利用离心力将细胞沉积到指定的微孔中，从而实现多种细胞类型的顺序接种，以生成多样化的球体。在CMS培养芯片的制备过程中，首先需通过计算机数控加工技术制备聚碳酸酯模具，用于培养芯片的顶层和底层。
接下来，将PDMS基础剂与PDMS固化剂按10:1的比例混合，搅拌5分钟，然后将混合物放入真空干燥器中脱气1小时，以去除气泡。将脱气后的PDMS混合物倒入CMS细胞培养芯片模具中，并将模具再次置于真空干燥器中抽气1小时，以除去残留的气泡。第二次脱气结束后，在80摄氏度的加热箱中固化2小时，随后将芯片放入真空等离子清洗仪中，待键合的表面朝上放置。
将培养芯片置于18瓦功率的气辅等离子体中处理30秒，并在80摄氏度的加热腔中将芯片的两层键合30分钟，以增强粘附强度。随后将CMS培养芯片在121摄氏度下高压灭菌15分钟。为准备细胞形成球状体，将含有5×10⁵至10×10⁵个目标细胞的1毫升冻存管在36.5摄氏度水浴中解冻2分钟，然后加入1毫升DMEM培养基，轻轻混匀。
接下来，将细胞加入含有15毫升36.5摄氏度培养基的150毫米直径培养皿中，并将培养皿置于细胞培养箱中培养24小时。次日，用15毫升新鲜DMEM替换上清液，并将细胞重新放回培养箱中。为使细胞脱落，加入4毫升胰蛋白酶，在36.5摄氏度和5%二氧化碳条件下消化4分钟，当细胞从培养皿底部脱落时，用新鲜培养基终止反应。
为了标记细胞，将适量的细胞荧光染料恢复至室温，然后向染料管中加入 20 微升无水二甲基亚砜，配制成 1 毫摩尔/升的溶液。将荧光染料用 DMEM 稀释至终工作浓度为 1 微摩尔/升，并加入到目标细胞悬液中，轻轻混匀。随后将细胞置于细胞培养箱中孵育 20 分钟。
进行单培养类球体形成时，首先在旋转芯片500至1,000转/分钟的同时，向CMS培养芯片的进样孔中加入2.5毫升4% Pluronic F-127溶液。待全部溶液加入后，使用CMS系统以4,000转/分钟旋转3分钟。旋转结束后，将培养芯片置于36.5°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。
次日早晨，移除Pluronic溶液，并用DMEM洗涤培养芯片。在洁净台中将芯片干燥12小时后，向进样口加入2.5毫升培养基，并以每分钟4,000转的速度旋转芯片3分钟。旋转结束后，在芯片以每分钟500至1,000转持续旋转的条件下，将进样口中的100微升培养基替换为100微升制备好的细胞悬液。
然后以每分钟 3,000 转的速度旋转芯片 3 分钟，通过离心力将细胞捕获在每个微孔中，随后将芯片置于细胞培养孵育箱中培养 3 天，每天按演示方法更换培养基。对于生成同心球形共培养结构，当芯片以每分钟 500 至 1,000 转的速度旋转时，将第一群细胞加入 100 微升培养基中，并注入芯片的进样口，随后以每分钟 3,000 转的速度旋转 3 分钟。旋转结束后，在芯片仍以每分钟 500 至 1,000 转的速度旋转时，加入 100 微升第二群细胞，并再次以每分钟 3,000 转的速度旋转 3 分钟。
当两种体积的细胞均注射完成后，将芯片放入细胞培养孵育箱中，在每分钟1,000至2,000转的转速下旋转培养24小时。对于Janus球形结构的形成，在芯片以每分钟500至1,000转旋转的同时加入100微升的第一群细胞，随后以每分钟3,000转继续旋转3分钟。旋转结束后，将芯片放入细胞培养孵育箱中，以每分钟1,000至2,000转的转速继续旋转培养3小时。
孵育结束时，在芯片以每分钟500至1,000转旋转的同时，加入100微升的第二群细胞，随后将芯片以每分钟3,000转旋转3分钟。然后将细胞置于细胞培养孵育箱中，在每分钟1,000至2,000转的条件下培养24小时。对于夹心型类球体的形成，首先在芯片以每分钟500至1,000转旋转时加入100微升的第一群细胞，随后以每分钟3,000转旋转3分钟。
旋转结束后，将芯片置于细胞培养孵育箱中的旋转仪上，在每分钟 1,000 至 2,000 转的条件下旋转两小时，然后在芯片以每分钟 500 至 1,000 转旋转的同时加入 100 微升的第二群细胞。以 3,000 RPM 旋转芯片三分钟，随后将芯片放回孵育箱中，在持续旋转条件下孵育三小时。接着，在芯片以每分钟 500 至 1,000 转旋转的同时，加入额外的 100 微升第一群细胞，并按照上述方法继续旋转并培养细胞 12 小时。
按照演示的方案操作，可成功制备直径为六厘米的CMS培养芯片。CMS培养芯片的通道包含一个进样口，以及中央区、滑动区和微孔区。如演示所示，在单个CMS芯片中，于培养最初24小时内以每分钟2000转的速度拍摄的两种细胞培养的延时图像，显示了类球体的成功形成。
培养三天后对微孔进行成像显示，球状体表现出优异的均一性和球形度。还可生成具有同心、Janus 和夹心结构的共培养球状体。此外，将细胞培养物在高重力条件下暴露七天后进行活/死染色，结果表明大多数细胞可在芯片内长期存活。
在键合CMS培养芯片的顶层和底层时，应仔细对齐，否则每个微孔中的细胞数量可能不相等。本研究可降低共培养类球体研究的入门门槛，并可广泛应用于共培养研究，例如用于筛选感兴趣的新型药物。
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概述
本研究介绍了一种由电机驱动的离心式微流控装置，用于细胞球体的培养。该装置能够在高重力条件下实现由单一或多种细胞类型组成的球体共培养。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞培养
- 生物医学工程
背景
- 细胞球体对于研究细胞相互作用和组织工程具有重要意义。
- 离心式微流控装置为细胞操控提供了一种新颖的方法。
- 高重力条件可增强球体的形成及其稳定性。
- 该技术能够利用多种细胞类型生成多样化的球体。
研究目的
- 开发一种简化细胞球体共培养的装置。
- 利用离心力实现细胞在微孔中的高效沉积。
- 探索高重力条件在球体培养中的潜在应用。
使用的方法
- 利用芯片实验室（lab-on-a-CD）平台生成球形细胞聚集体。
- 将多种细胞类型依次导入指定的微孔中。
- 使用聚碳酸酯模具和聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备培养芯片。
- 脱气与固化工艺以确保芯片结构完整性。
主要结果
- 从单一种类和多种细胞成功生成球状体。
- 展示了离心力在细胞沉积中的有效性。
- 高重力条件改善了球状体的形成与稳定性。
- 在组织工程和药物测试中具有潜在应用价值。
结论
- 所开发的装置是一种用于球形体培养的有前景工具。
- 离心微流控技术可提高细胞共培养的效率。
- 该方法为细胞生物学和组织工程领域的研究开辟了新的途径。
常见问题
行业高管相关性
基于CD的实验室平台可在受控的离心力条件下快速、可重复地生成多细胞三维球体，解决了临床前模型开发中的一个关键瓶颈。该系统支持将不同类型的细胞共培养为特定结构（同心、Janus、夹心结构），从而在靶点验证和表型筛选工作流程中增强机制性风险评估能力。通过提供与疾病相关、来源于人类的微组织，该技术显著提升了早期药物发现的预测可靠性，相较于单层细胞培养，能更真实地模拟体内细胞间的相互作用。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在明确的球状体几何结构中对人脂肪来源的干细胞和肺成纤维细胞进行可控共培养，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用精确的离心力应用（1×g 至 521×g）标准化球状体的形成，减少早期靶点结合实验中的变异性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可生成均匀、球形对称的多细胞球体，适用于药物筛选中的高内涵成像和定量检测。
- 操作价值：每张芯片含有100个相同的400 μm微孔，可实现平行实验操作，提高先导化合物筛选的通量。
转化与临床前研究
- 科学价值：支持生成可在长期高重力培养条件下（长达7天）维持活性的人源微组织，提高临床前模型的转化相关性。
- 操作价值：兼容标准细胞培养箱和荧光标记方案，无需特殊设备即可轻松整合到现有的临床前工作流程中。
流程与工作流整合
CMS 平台作为一种从发现到临床前的赋能技术，通过提供具有机制信息的多细胞模型，将类球体生成置于靶点验证与先导化合物优化阶段之间。
- 发现生物学：通过可控组装多细胞类球体，阐明疾病背景下间质-上皮或干细胞-微环境相互作用，支持假设验证。
- 筛选：在微孔阵列中生成大小和形态一致、可重复且可量化的类球体输出，实现对化合物反应的可靠测量。
- 分析：生成结构明确、兼容荧光标记的类球体，支持活/死染色、成像及终点检测，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：利用人原代细胞（脂肪来源干细胞、肺成纤维细胞）构建与疾病相关的系统，连接基础发现与临床前验证。
- 企业级复用：芯片采用PDMS和聚碳酸酯材料，通过可重复使用的CNC模具制造，支持团队间和多地点的标准化，实现类球体的规模化生产。
运营与企业影响
- 科学价值：通过精确控制细胞群体的空间分布，减少共培养模型中的机制模糊性，从而提高预测置信度。
- 操作价值：利用离心力驱动细胞均匀沉降到微孔中，确保标准化和可重复性，最大限度降低孔间变异性。
- 战略价值：通过在复杂且与人体相关的小型组织中早期评估化合物效应，改善“推进/终止”决策，降低后期研发失败风险。
- 项目组合影响：通过生成结构化的共培养类球体，为靶点选择和先导化合物优化提供依据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备微流控芯片操作、离心力校准以及无菌细胞培养技术方面的专业知识。
- 依赖于可编程电机驱动旋转系统（转速范围为500–5,200 RPM）以及用于PDMS芯片复制的数控加工聚碳酸酯模具的获取。
- 需要跨团队统一旋转方案、细胞接种密度和培养基更换时间表，以确保类球体的一致性。
- 应用于其他细胞类型时，可能需要优化Pluronic F-127包被时间及旋转速度，以防止细胞聚集或微孔占据不均。
- 实际限制包括芯片上下层键合过程中需手动对齐，若对齐不当会影响微孔细胞数量的一致性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Centrifugal Microfluidic-Based Spheroid (CMS) Culture Chip Fabrication
2:06
Cell Preparation
3:10
Cell Staining
3:45
Monoculture Spheroid Formation
5:33
Co-Culture Spheroid Formation: Concentric Spheroid Formation
6:28
Co-Culture Spheroid Formation: Janus Spheroid Formation
7:33
Co-Culture Spheroid Formation: Sandwich Spheroid Formation
8:48
Results: Representative CMS Culture Chip Spheroid Culture Analyses
9:51
Conclusion
