单个内吞溶酶体囊泡分析的膜片钳技术

内吞溶酶体区室是细胞中最小的细胞器。传统的电生理技术无法直接测量其电压和电流变化。内吞溶酶体膜片钳技术可实现直接记录，使我们能够研究此前难以观测的离子通道。

主要的实验挑战在于，并非所有化合物都能有效增大溶酶体。鉴定合适的细胞十分困难，即使拥有理想的溶酶体，也不能保证成功记录离子通道。我们开发了内溶酶体膜片钳技术，从而实现了对内溶酶体膜的直接电生理记录。

这一突破使我们能够表征离子通道（如 TRPMLs 和 TPCs），揭示它们在病原体防御、神经元退化和代谢紊乱中的作用。我们的方法可实现对溶酶体离子通道的直接记录，克服了全细胞膜片钳技术在尺寸上的限制，改善了囊泡筛选，并整合了基于荧光的技术。首先，将毛细管安装到极轴上。

按下键盘上的绿色拉制按钮。松开夹紧旋钮，将拉制好的移液管从拉制仪上取下。接着，将拉制好的膜片钳移液管放入显微拉制仪的支架中。

使用35倍物镜结合15倍目镜（总放大倍数为525倍）检查移液管尖端。利用显微操作器将膜片钳移液管移至纤维附近。将温度调节旋钮设置为80。

打开加热器后，按住脚踏开关一到两秒钟，以施加短暂的热脉冲。抛光完成后，将抛光好的移液管放入密封盒中，防止灰尘污染。向浴槽中加入一毫升浴液。

从24孔板中取出带有经处理的HEK 293细胞的盖玻片，将其转移至显微镜灌流腔室。使用自制的塑料填充针将灌流电极液注入记录电极中。

将装液的移液管安装在膜片钳装置的前端。在配备40倍物镜和10倍目镜的显微镜下，移动分离移液管至足够放大的内体或溶酶体附近。使用显微操作器缓慢降低分离移液管，直至其接触细胞膜边缘。

迅速移动移液管以撕下膜的一小部分。使用同一根移液管，从细胞的对侧按压细胞，挤出距离细胞约两微米的内体/溶酶体。用适当的移液管溶液填充新抛光的膜片移液管。

将移液管安装至放大器前端。向移液管施加20至50毫巴的正压，并通过锁定阀门维持该压力。随后，将移液管尖端移入浴液中，并将其置于视野中央。

施加重复的电流脉冲以测定移液管电阻、封接电阻和串联电阻。监测移液管尖端大小、封接形成以及全内体-溶酶体构型的建立。迅速将移液管移至目标囊泡顶部附近。

观察囊泡由于移液管液体流动而移动或滚动。将移液管的偏置电压调节至零毫伏。立即释放正压，使囊泡被吸入移液管，于一秒钟内形成吉欧封接（gigaseal）。

进行全囊泡记录时，使用持续时间为2至5毫秒的高压短脉冲，破坏移液管与细胞器接触点处的膜。电压设置为500至1000毫伏。为记录电流，采用多种输入电压进行内体-溶酶体电压钳实验，以评估膜特性。

在吉欧姆封接形成过程中，电流响应迅速减小，表明已成功建立溶酶体附着模式。通过重复施加持续输入电压，记录到跨内体-溶酶体膜的电流，显示出基础电流、激动剂激活的电流以及漏电流。