插入突变细胞文库中功能相关慢病毒整合位点的鉴定

我们正在开展功能基因组学研究，重点在于识别和表征人类基因组中的功能元件。我们的主要兴趣是探索基因组中尚未被充分注释的部分，以更深入地理解其潜在作用及其在人类生物学与疾病中的可能贡献。目前的反向遗传学工具存在一些局限性，例如非特异性效应，以及构建SSI或SGI复杂文库时的高成本。

另一个挑战在于，该方法可能仅能靶向已知的基因组元件，导致基因组的大部分区域仍未被充分探索。本文开发的方案提供了一种新方法，可用于鉴定先前未知的基因组元件，包括蛋白质编码基因和长链非编码 RNA 中的新型功能外显子。首先，以从基于慢病毒的插入突变细胞文库中分离得到的基因组 DNA 作为模板，在 50 微升反应体系中进行线性 PCR 扩增。然后。

将此处所示其他所需试剂加入PCR管中。在标准的PCR扩增仪中，按照给定的PCR条件进行50个循环的线性PCR反应。将PCR产物转移至新的洁净1.5毫升离心管中。

将PCR产物与10微升链霉亲和素-生物素磁珠充分混合，在金属浴中室温下以400 RPM振荡孵育两小时。然后，使用磁力架收集磁珠，并小心移除上清液。用300微升结合缓冲液或洗涤缓冲液洗涤磁珠六次，每次洗涤后弃去上清液。

对于第二链合成，将磁珠重悬于含有Klenow片段缓冲液、dNTP混合物和P5N6引物的24微升反应体系中，置于PCR管内。在PCR仪中于15摄氏度预孵育20分钟，然后向反应体系中加入2单位的Klenow片段。在指定条件下，于PCR仪中孵育反应体系。

然后，将PCR产物转移至一个新的洁净1.5毫升离心管中。使用磁力架捕获磁珠，并弃去上清液。随后，在4°C下，用300 µL无DNase和RNase的去离子水轻轻洗涤磁珠。

收集磁珠并弃去上清液。将磁珠重悬于25 µL PCR反应体系中，该体系包含Taq缓冲液、Taq DNA聚合酶、引物P5、dNTP混合物以及引物3-LTR_Nest，并置于PCR管中。使用此处所示程序在热循环仪中进行PCR反应。

取5 µL PCR产物作为模板，使用Illumina P5引物和Illumina P73-LTR引物进行下一轮PCR反应。在热循环仪中按照给定条件进行PCR。然后，将PCR产物转移至洁净的1.5 mL离心管中。

将磁珠从2–8摄氏度平衡至室温30分钟后，通过倒置或涡旋充分混匀。用移液器吸取磁珠体积1.2倍的量，转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。将PCR产物加入磁珠中，并通过上下吹打10次充分混匀。

孵育磁珠，使DNA结合到磁珠上。然后将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清液。接着用200微升80%乙醇洗涤磁珠。

室温孵育30秒，去除上清液。打开管盖，室温下将磁珠晾干约5分钟。然后，将试管从磁力架上取下。

加入 22 微升无 DNase 和 RNase 的蒸馏水。用移液器上下吹打 10 次以充分混匀，并在室温下静置两分钟。将离心管放回磁力架上，直至溶液变澄清。

然后，将21微升上清液转移至一支洁净的1.5毫升离心管中。使用荧光计测量浓度时，通过将试剂与缓冲液按1:200的比例混合，配制工作液。分别取10微升标准品一和10微升标准品二，各与190微升工作液混合，以制备检测用标准品。

轻轻涡旋混合物2到3秒。接下来，通过将1微升纯化的PCR产物与199微升工作液混合，制备检测样品。再次轻轻涡旋混合物2到3秒。

将检测标准品和检测样品在室温下避光孵育两分钟，然后打开荧光仪。从主菜单中选择双链DNA高灵敏度检测程序。进行校准：将标准品一插入仪器，按下读取标准品按钮，以测定第一个标准品。

然后，插入标准品二并按下读取标准品按钮，以测定第二个标准品。进行样品测定时，按下运行样品按钮，进入样品测定页面。插入每个含有待测样品的试管，并按下读取试管按钮，以获得样品浓度。

在低质量样本中，约83个碱基处出现一个主导峰，表明存在接头二聚体污染。相比之下，高质量的NGS文库在150至1,500个碱基之间呈现主峰，反映出成功文库的特征谱型。