逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本实验的总体目标是从大量基因组DNA中通过PCR扩增逆转录病毒整合位点，并对所得的DNA文库进行测序，从而将精确的整合位置比对至参考基因组。该方法可通过分析整合位点在整个宿主基因组中的分布情况，帮助回答基础与临床逆转录病毒学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于其DNA测序深度，以及可在一次测序运行中对多个样本进行多重检测的能力。

转染前一天，将3.3 × 10⁶个HEK293T细胞接种于五块100毫米培养皿中，每皿加入10毫升添加了补加物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）。次日，使用 commercially available transfection reagents 或磷酸钙法，将携带全长逆转录病毒分子克隆的10微克质粒，或9微克包膜缺失的单周期载体加1微克VSV-G表达质粒共转染细胞。将转染混合物逐滴加入细胞培养基中。

转染后，将细胞置于含5%二氧化碳的湿润化细胞培养箱中，37摄氏度孵育。约48小时后，使用刻度移液管收集含有病毒的细胞培养基，并通过重力流使其经过0.45微米滤器过滤。接下来，在4摄氏度条件下，以200,000 ×g超速离心1小时浓缩病毒。

离心后，除去上清液，直至剩余约 500 微升 DMEM FPS，重悬病毒沉淀。加入 20 单位 DNase，在 37 摄氏度孵育 1 小时。根据制造商说明书，使用 HIV-1 p24 抗原捕获试剂盒测定 p24 浓度。

感染前一天，在六孔板中每孔加入2.5毫升含血清DMEM培养基，接种3.0 × 10⁵个HEK293T细胞，于组织培养孵箱中过夜培养。用500微升新鲜含血清DMEM培养基稀释病毒，使终浓度为500纳克/毫升p24，对细胞进行感染。在组织培养孵箱中孵育2小时。

2小时后，向每个孔中加入2毫升预热至37摄氏度的含血清DMEM培养基，并将培养板放回培养箱中。感染后48小时，吸去培养基，用2毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞。加入0.5毫升预热至37摄氏度的胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，数秒后在显微镜下观察各孔细胞是否已脱落。

随后加入2毫升预热的含胎牛血清的DMEM培养基，用刻度移液管轻轻吹打10次以重悬细胞。将悬液转移至含有18毫升预热的含胎牛血清的DMEM培养基的75平方厘米组织培养瓶中，并放回组织培养孵箱。感染后至少五天，按前述方法收集细胞，并用移液管将其重悬于5毫升预热的含胎牛血清的DMEM培养基中。

将溶液在室温下以2,500 ×g离心5分钟，然后吸除并弃去上清液。最后，使用市售试剂盒从细胞沉淀中提取基因组DNA。用200微升pH为8.5的毫摩尔Tris-HCl缓冲液从提供的离子交换柱中洗脱DNA。

基因组DNA超声处理后，使用PCR纯化试剂盒纯化超声处理后的DNA。接着，利用末端修复试剂盒对DNA进行修复。DNA再次按前述方法纯化后，使用Klenow Exo-Minus酶对DNA进行A尾修饰。

或者，通过限制性内切酶消化进行片段化：使用能够产生5'TA突出端的多种酶混合物，以及一种不相容的酶（如在上游病毒LTR下游切割的BglII），对基因组DNA进行切割。在终体积为100微升的反应体系中，切割10微克基因组DNA。在37摄氏度下孵育过夜。

使用PCR纯化试剂盒确保最终DNA的纯度。与超声处理DNA联用的接头必须含有相容的T 3'突出端，而用于MseI消化DNA的接头则必须含有相容的5'TA突出端。首先，将10微摩尔的短链和长链接头在35微升Tris-HCl EDTA缓冲液中退火，加热至90摄氏度后，以每分钟降低1摄氏度的速率缓慢冷却至室温。

接下来，每个基因组DNA样本需制备至少四个平行的连接反应，每个反应体系总体积为50微升，包含1.5微摩尔的连接接头、1微克片段化DNA和800单位的T4 DNA连接酶。在12摄氏度下连接过夜。对于通过超声处理制备的样本，使用一种可在上游LTR下游切割的限制性内切酶对纯化的连接反应产物进行消化。

在制造商推荐的条件下，使用100单位的相应酶过夜反应。确保使用PCR纯化试剂盒对最终产物进行纯化。使用此处所示的试剂制备第一轮PCR。

使用以下参数进行第一轮PCR：94 °C 预变性2分钟，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C 变性15秒、55 °C 退火30秒、68 °C 延伸45秒，最后在68 °C 延伸10分钟。将第一轮PCR反应产物混合，并按前述方法纯化DNA。

然后准备第二轮PCR，其中包含此处所示的试剂。PCR循环参数与第一轮PCR相同。第二轮反应结束后，合并并纯化DNA，进行质量控制和下一代测序，并按照方案书面部分的详细说明分析整合位点。

使用 Web Logo 软件对通过限制性内切酶消化（如左图所示）或超声处理（如右图所示）制备的文库中的整合位点进行比对。滴定系列中的每个稀释度均被展示，从图顶部的未稀释 DNA 到底部最高稀释度 1:15,625。随着感染细胞 DNA 稀释度的增加，测定的确定性降低。

此图像显示了匹配的随机对照中 50,000 个独特基因组位点的序列标志图。请注意，来自 MRC 数据集的随机位点比对未能产生明显的碱基偏好性。一旦掌握该技术，可在三天内从基因组 DNA 制备整合位点文库。

因此，从初始感染到完成生物信息学分析的整合位点作图可在约两周内完成。通过该实验流程，可对成千上万甚至数百万个独特的逆转录病毒整合位点进行编目，并可开展多种分析，以量化插入位点与基因组注释之间的关联性。