Drosophila melanogaster 过度梳理行为表型评估中的梳理行为量化方法

本研究通过RNAi介导的Atg8a基因敲降，模拟图雷特综合征患者中观察到的GABARAP功能缺陷，评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的理毛行为。我们旨在阐明aAtg8a在行为发育中的作用，从而深入理解其人类同源蛋白在神经行为过程中的调控功能。目前，采用人工注释方法存在若干实验挑战，包括复杂的分析流程（如视频注释与审阅）以及人工注释过程中固有的主观性。

自动化方法也面临一些挑战，包括需要具备较强的计算机科学专业知识才能有效实施和操作。我们发现，基因 Atg8a 在果蝇行为发育中所起的作用超出了此前已知的范围。更具体而言，我们发现该基因同时调控梳理行为和学习能力，提示 Atg8a 的同源基因可能在其他生物中也具有类似功能。

该技术可直接定量分析果蝇的梳理行为频率及分布情况。对于无法使用自动化方法的实验室而言，此方法尤为适用，且相较于基于染料的间接方法，可实现更详细的分析。总体而言，本研究推动了果蝇作为研究伴有强迫行为的神经发育障碍（如抽动秽语综合征）模型生物的应用。

此外，这还增加了自噬相关蛋白在行为发育中发挥作用的越来越多的证据。首先，将四个三孔培养皿并排置于白色表面上，每个培养皿上覆盖一块玻璃盖片。将相机置于培养皿上方。

确保载玻片上无反光，以免影响观察培养皿中果蝇的可见度；必要时调整培养皿位置或调暗灯光以消除反光。现在，在进行录像的实验台面上标记培养皿和相机的位置。将四至九日龄的果蝇置于覆盖有Parafilm和纸巾的冰块上，进行轻微麻醉。

麻醉后，应尽快使用画笔将果蝇转移至观察室。在三孔板的每个孔中各放置一只果蝇，操作时需尽量轻柔，以避免干扰果蝇，防止引发应激相关的行为改变。在麻醉后让果蝇适应环境30分钟，随后使用相机记录果蝇行为，然后打开终端并输入 cd PiSpy。

输入 python3 PiSpy.py，然后输入所需的录制时长和帧率。选择所需的分辨率，然后单击快速捕获。

现在使用 Pi Spy 中的预览相机功能，确保果蝇处于焦点且清晰可见。以推荐的每秒 24 帧的帧率录制果蝇活动 10 分钟，并保存文件。为分析视频，将文件导入 ELAN 6.8 软件，对梳理行为进行详细标注和深入分析。

选择层级，添加新层级，在层级名称中输入培养皿中的位置信息，并进行添加，以将每一行分配用于手动标注个体的行为片段。要标注行为，需双击待标注的层级，右键单击并沿该层级拖动光标，划定个体表现出单次理毛行为的时段。单击以选择新的标注区域，然后双击新高亮的时间段，输入在该时间点所观察到行为的缩写。

视频完成注释后，点击“查看”，然后选择“注释统计”，以获取每种行为的详细分类。将发生于果蝇身体前部区域的 grooming 行为识别为前部 grooming；将发生于果蝇身体前后端区域的 grooming 行为识别为后部 grooming。

与对照组相比，Atg8a RNAi 突变体的理毛行为持续时间显著增加。Atg8a RNAi 突变体用于理毛的时间也显著高于对照组。在前部与后部理毛行为的分布上未观察到显著差异。