表征pH依赖性可逆自组装的Aβ 1-40包被金胶体

我的研究重点是获取淀粉样蛋白β 1-40在吸附于金纳米颗粒表面并发生可逆聚集过程时的关键构象确认信息。本研究领域面临的挑战在于，如何获得该逆向聚集过程的热力学、化学及动力学信息。本项目的重要发现是，我们能够识别出当淀粉样蛋白β 1-40吸附于金纳米颗粒表面时，对其折叠或去折叠构象起贡献的特定运动或振动模式。

使用SERS（表面增强拉曼散射光谱）的最大优势在于能够检测到非常微弱的散射信号，从而识别出导致蛋白质折叠与去折叠的关键模式。同时，我们能够精确定位聚集体的形态。本项目所获得的研究发现揭示了蛋白质-蛋白质相互作用的关键机制，这种相互作用对于寡聚体的形成至关重要，并将最终导致纤维生成。

首先，使用微量移液器将一毫升去离子蒸馏水加入一毫克冻干的淀粉样蛋白 β（Aβ 1-40）中。用涡旋混合器混合溶液约 30 秒。确保在室温（约 20 °C）下溶液中无任何固体颗粒残留。

接下来，使用去离子蒸馏水配制肽段储备液。通过分光光度法在275纳米处测定酪氨酸的吸收值来确定肽段浓度。将Aβ 1-40储备液于-80°C保存。

在数据采集前约五分钟解冻肽段储备液。在15毫升离心管中，将8微升肽段溶液与800微升金胶体颗粒混合。加入4.2毫升去离子蒸馏水，然后涡旋震荡样品10秒。

将 Aβ 1-40 肽的浓度固定在 1.8 纳摩尔，并在特定范围内调节肽与胶体金颗粒的比例。利用紫外-可见分光光度计的温度控制单元，将溶液温度设定为室温，约 22 摄氏度。使用 pH 计监测样品溶液的初始 pH 值，并将其调节至略低于 pH 7。

在400至800纳米范围内采集吸收光谱。然后，通过逐次加入1.0 µL的1.0 M盐酸，将样品的pH值调节至约pH 4。再次在相同的400至800纳米范围内采集吸收光谱。

接下来，通过逐次加入约1.5微升的1.0摩尔氢氧化钠溶液，将样品的pH值调节至约pH 10。在相同的400至800纳米波长范围内采集吸收光谱。随后，通过加入盐酸或氢氧化钠，将pH值在pH 4至pH 10之间反复调节10次。

在 25 摄氏度下连续采集吸收光谱。获取以吸光度为函数的波长 ASCII 数据集。使用 PeakFit 程序提取谱带峰的平均位置。

使用绘图函数绘制数据集，以可视化光密度随波长的变化关系。通过在绘制的图谱中选择其大致位置，确定并标记初始峰波长 λ₁ 和 λ₂。使用 Origin 软件的峰拟合功能对数据进行拟合。

获取显示每个标记为 XCI 的拉曼位移（lambda）对应的中心峰位置的图谱，以及相应的谱带面积，记为 AI。将提取的峰位置及对应的面积导出至电子表格程序进行分析。通过使用显示的公式，将每个谱带的面积与所有谱带总面积进行比较，计算每个峰中心的权重因子 AI。然后，使用屏幕上显示的公式计算平均峰位置。

为了生成可逆性曲线图，将平均峰位作为操作次数 N 的函数进行列表。根据屏幕上显示的编号分配操作次数 N。使用显示的公式分析 N 次操作时的峰位。将计算得到的数据集导入 Origin 软件并绘图。

选择非线性曲线拟合分析，输入参数 A、B、C、D 和 E 的初始值，然后点击运行以完成曲线拟合过程。进行拉曼成像时，对操作编号为 N 的每个样品，取 100 µL 溶液滴加到直径为 1 cm 的云母圆片上。样品在测量前需静置过夜使其自然干燥。

接下来，针对每个操作编号 N，采集白光图像。在新的云母片上制备独立样品，并持续改变 pH 值，范围介于 4 至 10 之间。针对每个操作编号采集拉曼图像，并使用波长为 633 纳米的激光，按照前述参数设置进行。以 100 × 100 像素的网格采集图像，设定特定的积分时间，聚焦于目标光谱区域。

将每个操作次数 N 对应的代表性光谱按 N 的函数关系进行对齐绘制。针对 Aβ1-40 包被的 20 纳米金颗粒，构建随操作次数 N 变化的三维表面增强拉曼光谱（SERS）。利用光谱的俯视图作为等高线图，提取与特定 pH 条件相关的特征振动模式。识别仅在偶数或奇数操作次数下特异性增强的光谱特征。

Aβ 1-40包被的金纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）吸收带在溶液酸性增强时从530纳米红移至约650纳米。这对应于在透射电子显微镜（TEM）下观察到的、由去折叠的Aβ 1-40单体介导形成的金胶体聚集体。Aβ 1-40包被金纳米颗粒的pH依赖性颜色变化也十分明显。

平均吸收带在较短和较长波长之间的可逆pH依赖性位移，以及透射电子显微镜（TEM）中观察到的交替分散与聚集形态，证实了该过程的准可逆特性。白光成像显示了与pH变化相对应的清晰且可逆的聚集模式，而表面增强拉曼光谱（SERS）在指纹区则呈现出细微的pH依赖性变化。