1,2-二硫杂环戊烷修饰的自组装肽的合成与表征

随着超分子结构功能的不断增强，将1,2-二硫杂环戊烷基团引入自组装肽的方法有助于解答关于超分子表面反应性的关键问题。该技术的主要优势在于，1,2-二硫杂环戊烷前体分子的偶联与脱保护反应均在树脂上进行，最终修饰肽仅需一次纯化步骤。由于组装体成熟为最终超分子结构所需时间各不相同，对超分子组装体的表征方法及结果进行直观展示至关重要。

为了合成二硫代环戊烷前体，首先将一克3-溴-2-丙酸溶解于约四毫升一摩尔氢氧化钠溶液中，置于50毫升圆底反应瓶内，在55摄氏度下搅拌。当所有试剂均悬浮于溶液中后，用隔膜密封反应瓶，并将反应瓶置于氮气氛围中。接着，将1.49克硫代乙酸钾和三毫升二摩尔硫酸加入四毫升去离子水中，原位生成硫代乙酸。

用塑料一次性10毫升注射器吸取硫代乙酸溶液，并安装18号针头，然后用针头刺穿隔膜，将混合物逐滴加入反应瓶中，在55摄氏度下继续反应过夜。次日早晨，使用甲醇与二氯甲烷混合溶剂，在硅胶60 F254板上通过薄层色谱监测反应，用溴甲酚绿染色观察反应进程。当反应完成并冷却至室温后，用2摩尔硫酸将混合物酸化至pH为1。

应有黄色油状物从溶液中析出，随后用三份40毫升的冷氯仿萃取产物，并合并有机相，用硫酸镁干燥，再在减压条件下除去氯仿。产物为黄色油状物，总收率为83%，可不经进一步纯化直接使用。为将二硫杂环戊烷前体偶联到树脂上肽链的N端，向5毫升二甲基甲酰胺中加入四当量的二硫杂环戊烷前体、四当量的HBTU以及十当量的DIPEA。

将偶联混合物在室温下预活化10分钟，然后将其加入含有N端树脂的带砂芯过滤片的注射器中。将偶联反应振荡反应两小时，随后用新鲜的二甲基甲酰胺洗涤三次，每次5毫升，并重复偶联反应及过夜振荡。第二次偶联反应结束后，先用二甲基甲酰胺洗涤树脂三次，每次5毫升，再用二氯甲烷洗涤树脂三次，每次5毫升，随后将干燥的树脂转移至10毫升微波反应管中。

然后，为了脱去N端二硫代烷前体上的硫代乙酸基团，向反应管中加入2毫升二甲基甲酰胺。让树脂充分溶胀，向容器中加入一个小型磁力搅拌子，并通过低速磁力搅拌重新悬浮树脂。15分钟后，向反应管中加入2毫升浓氨水，用硅胶隔垫密封反应容器，并将容器置于微波反应仪中，在75摄氏度下搅拌反应45分钟。

微波反应完成后，将树脂转移至一个洁净的一次性带砂芯漏板的注射器中，用两份5毫升的二甲基甲酰胺和两份5毫升的甲醇依次洗涤树脂。最后一次洗涤后，在室温下向含有树脂的注射器中加入5毫升裂解液，轻轻振荡孵育1.5小时。为制备1毫升用于高效液相色谱（HPLC）纯化的粗肽溶液，将400微升溶于乙腈的浓缩肽原液加入600微升含0.1%三氟乙酸的水中，并通过22微米的注射器滤膜过滤至HPLC样品瓶中。

为了纯化多肽，使用C18半制备柱，在20分钟内以每分钟3毫升的流速进行15%至55%乙腈的线性梯度洗脱，同时将紫外检测器设定在222纳米和330纳米。随后收集并合并目标峰。为通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认多肽产物，取0.5微升收集的峰样，与含有0.5微升2,5-二羟基苯甲酸基质的基质辅助激光解吸/电离靶板混合。

为制备自组装溶液，将一毫克冻干肽粉末溶解于含有20%乙腈和10毫摩尔HEPES的混合液中，置于1.5毫升微量离心管内，随后涡旋振荡使溶液充分混合，并将样品在室温下静置以完成自组装。当肽自组装达到成熟状态后，取8至10微升组装溶液在衰减全反射金刚石晶体表面干燥成薄膜，并监测1640至1631 cm⁻¹范围内宽大的水峰随薄膜形成而逐渐消失的过程。采集1500至1800 cm⁻¹波数范围内的背景和红外光谱，每次平均扫描50次，分辨率为2 cm⁻¹，并在每次样品扫描前扣除背景扫描信号。

应观察到β折叠组装的红外特征峰位于1625至1635 cm⁻¹之间的一个尖锐峰。当肽样品已成熟为富含β折叠的超分子结构时，取10 µL肽组装溶液滴加到透射电子显微镜碳支持膜载网上，使组装体在载网表面吸附1至2分钟。用滤纸轻轻接触载网边缘以去除多余样品，随后在载网表面加入10 µL新配制的2%醋酸铀染液，染色2至3分钟，再用滤纸吸去多余染液，将载网置于真空干燥器中过夜，次日进行透射电子显微镜成像。

除了二硫戊环前体分子的初始一步合成外，其余1,2-二硫戊环修饰肽的合成均在固相载体上进行。在将3-溴-2-丙酸转化为3-巯基-2-丙酸（即二硫戊环前体）后，需通过氢核磁共振（¹H NMR）和碳-13核磁共振（¹³C NMR）确认其结构，然后将其偶联至仍连接在树脂上的肽链游离N端氨基。脱保护后，粗产物通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF质谱）确认产物的分子量。

傅里叶变换红外光谱和圆二色光谱可用于监测纯化的1,2-二硫戊环肽在成熟淀粉样纤维自组装过程中的变化，以表征其延伸的β片层构象。随后可通过透射电子显微镜对这些纤维进行成像。尽管这些方法可用于修饰仍连接在树脂上的任意肽序列的N端，但需注意每种肽的自组装条件应分别优化。

这些技术可将1,2-二硫杂环戊烷基团引入自组装肽中，将使生物材料领域的研究人员能够探索超分子表面反应性。