采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

本研究聚焦于确定免疫调节药物及复杂实体胃肠道肿瘤的作用靶点。分析肿瘤微环境的细胞图谱对于理解肿瘤对免疫治疗等疗法的敏感性至关重要。单细胞测序和流式细胞术有助于表征肿瘤微环境，但缺乏空间信息。近年来，多重成像和转录组学平台相继出现，可用于在体内环境下研究肿瘤微环境。

目前可用于分析肿瘤微环境的多重技术，无论是迭代式还是一体化方法，均局限于二维层面。本方案将表征扩展至深度维度，从而提供超越单个FFPE或冷冻切片的洞察。

[旁白] 首先，将组织片转移至含有温热收获培养基的样品杯中，并将其置于准备台上的加热板上。将组织固定在含有收获培养基的15厘米培养皿中的支架上。小心地将带有肿瘤的组织以间皮面朝上方向覆盖在支架的小孔侧，并用2-0丝线缝合固定。将准备好的组织支架倒置并完全浸入含有收获培养基的24孔板中。进行固定时，向一个含有30毫升冷PBS的50毫升锥形管中加入10毫升固定剂原液，配制40毫升固定缓冲液。使用镊子将固定在支架上的组织转移至固定缓冲液中，在4摄氏度下孵育24小时。倾去固定液，更换为40毫升冷PBS，在4摄氏度下孵育10分钟。进行染色时，向一个孔中加入1毫升封闭缓冲液，并插入组织支架，在室温下以30 RPM低速摇床上封闭至少2小时。在微量离心管中配制0.8毫升抗体染料溶液，在室温下以10,000 g离心2分钟。将0.75毫升上清液转移至9孔孵育板的一个洁净孔中，并插入已清洗的支架。用铝箔包裹该板，在室温下以30 RPM低速摇床上孵育至少2小时。在含有40毫升PBS的50毫升锥形管中于4摄氏度下洗涤支架10分钟。向3.5厘米成像皿的玻璃底部中央加入0.1毫升PBS，并暂时放置一旁。将高度调节环松散地顺时针旋入外盖中。将支架安装在内层塑料 holder 中，确保缺口槽对齐。用滑块固定支架。将组装好的成像适配器放置在玻璃底皿上，小心降低高度调节环，直至组织接触缓冲液。当达到玻璃表面的最佳距离后，将0.2毫升PBS加到组织上表面（底部朝上），以防止成像过程中组织脱水。启动图像采集软件。选择合适的物镜，例如20X或40X，并添加相应的浸没介质。设置图像采集参数，如600赫兹的扫描速度、1024×1024像素的XY分辨率、三线平均以及双向扫描。选择适当的激光线，或调节白光激光器以匹配染色所用荧光染料的激发和发射光谱。将组装好的成像皿放入显微镜载物台的样品 holder 中。使用XY控制将样本居中，将物镜升至盖玻片位置，开始图像采集。每次成像后，执行一次漂白步骤。在蒸馏水中配制5毫升浓度为1.5毫克/毫升的硼氢化锂溶液，在室温下孵育30分钟。将1毫升硼氢化锂溶液转移至9孔孵育板的一个洁净孔中，并插入已清洗的支架，在室温下孵育60分钟。在锥形管内的20毫升PBS中短暂洗涤支架。使用Z补偿的最高激光设置检查残留的荧光信号。此处展示的是经第一轮迭代漂白扩展多重检测（IBEX 1）抗体组合染色的带瘤腹膜样本可视化结果。肿瘤病灶被识别为呈菊形团样结构，同时表达CD44和podoplanin，其细胞核排列特征符合乳头状间皮瘤。此处展示了来自带瘤腹膜样本选定区域的高分辨率免疫荧光图像。这些图像揭示了肿瘤区域与肿瘤三级淋巴样结构界面，显示出一致的免疫细胞浸润，伴有高密度的CD45阳性细胞。该图展示了IBEX第1至第6个循环中的迭代免疫荧光染色，阐明了肿瘤病灶及肿瘤三级淋巴样结构界面内免疫标记物和结构标记物的空间分布。此处展示了不同光学切片的最大投影图像。三维成像证实，肿瘤病灶与三级淋巴样结构位于不同的Z轴深度，表明二维成像在解析复杂组织结构方面的局限性。