朊病毒安全实验室拭子检测

我们的多学科研究团队正致力于探究一种传染性蛋白质——朊病毒，如何执行复杂的生物学功能。我们还关注朊病毒如何在环境中持续存在数年甚至数十年。在完成朊病毒去污染程序后，目前尚缺乏一种可靠的方法来评估朊病毒失活的有效性。

我们正通过研究努力解决这一问题。采样拭子法结合RT-QuIC技术，可对多种表面进行取样，以检测朊病毒的种子活性。该方法可用于实验室、临床或环境条件下与表面相关的朊病毒检测。

我感兴趣的是朊病毒如何与表面相互作用，以及表面结合的朊病毒建立感染所需具备的条件。首先，确定并标记适合采样的监测区域。为每个确定的区域准备两个1.5毫升的微量离心管，在第一个管中加入250微升DPBS，第二个管保持空置。

从无朊病毒污染的区域取出储存的泡沫头拭子。使用适当的脑组织匀浆或DPBS中的脑组织匀浆（BH）制备阳性和阴性对照。佩戴洁净手套，从包装中取出所需数量的泡沫拭子，并将其手柄朝下放入试管架中。

确保拭子尖端不接触其他表面。用手握住干净的泡沫拭子柄，将50 µL相应的阳性和阴性对照样品分别加到拭子尖端。使用剪刀将拭子柄过长的部分剪去，使其长度约为原长的一半，然后将拭子放入预装的微量离心管中，使泡沫尖端浸入DPBS中。

手持干净的海绵头拭子手柄，用分子级水预先润湿海绵头，并甩去多余水分。将湿润的海绵头置于选定的监测区域，来回擦拭约10次，同时在表面同步旋转拭子头部。使用剪刀将拭子手柄过长部分剪去，保留约一半长度，然后将拭子放入预装的微量离心管中，使海绵头浸入DPBS溶液，确保管盖能够完全闭合。

在前往下一个采样位点之前，丢弃手套并更换新手套，以尽量减少交叉污染。进行拭子提取时，将微量离心管放入圆形试管架中，并将试管架浸入杯状超声水浴中。确保管内含DPBS的泡沫拭子完全浸没于水面以下，而手柄部分不被浸湿。

总共超声处理样品15秒，采用工作5秒、间歇5秒的循环模式。超声处理后，将离心管离心约15秒，使DPBS溶液聚集于管底，以便转移。使用P1000移液器并调至250微升，小心吸取管底全部液体拭子提取物，转移至相应预先标记的空管中。

弃去含有拭子的已使用离心管。将样本放入真空浓缩仪中进行浓缩，确保离心管盖处于打开状态；浓缩循环结束后，确认样本已完全浓缩，仅剩沉淀物。将沉淀物于-80摄氏度保存，直至后续使用。

进行RT-QuIC分析时，使用相应的脑组织匀浆液加入组织稀释液稀释后，制备阴性对照板和阳性对照板。现在将保存在-80摄氏度冰箱中的拭子提取物沉淀解冻，并用移液器加入50 µL分子生物学级水重悬干燥的拭子提取物。短暂涡旋振荡后，将样品置于室温下静置。

将2 µL的阴性对照和阳性对照板样品，以及拭子提取物分别加入RT-QuIC板的相应孔中。阴性对照拭子未跨越阳性荧光阈值，证实操作过程中无污染。阳性对照拭子提取物在所有重复孔中均表现出一致的种子效应，表明检测灵敏度符合要求。

来自非污染区域的表面拭子样本未显示超过阈值的扩增信号，证实无朊病毒存在。朊病毒污染的表面样本显示出超过阈值的扩增信号，其最大扩增点比值和荧光时间与对照组相比存在差异。经漂白剂处理的朊病毒污染表面未产生RT-QuIC扩增信号，表明消毒有效。

一些表面污染物表现出异常的动力学曲线和更长的荧光时间，提示可能存在假阳性结果，这很可能是由于表面存在灰尘或残留化学物质所致。