全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

我们的研究致力于开发和研究视网膜类器官，这类器官可作为人类体外模型，用于研究人类视网膜的形成过程、疾病的影响机制以及潜在的治疗方法。

为了推动再生医学领域的研究，我们采用三维视网膜类器官结合光学透明化和免疫标记技术，通过共聚焦显微镜对整个结构进行可视化，并研究视网膜细胞的特殊组织结构。

整体成像面临诸多挑战，例如在致密组织中抗体渗透不均以及类器官中的球面像差，这些问题会导致组织可视化过程中出现表面标记偏好和焦点丢失。

我们的方法揭示了视网膜细胞的连接方式、细胞类型及其三维组织结构，为理解视网膜疾病的潜在病因提供了关键见解。

[讲师] 首先，取用溶解于无水DMSO中、已脱水并冷冻保存的荧光染料分装样品。向一份分装样品中加入1至10微升DMSO。然后，将50微升二抗免疫球蛋白G或一抗、6微升1摩尔碳酸氢钠以及1至5微升荧光染料混合，在室温下避光于摇床上孵育40分钟。在反应进行的同时，取下纯化凝胶过滤柱的盖子，使缓冲液流过柱体。用2至3毫升PBS重复过柱三次，以平衡层析柱。若最后一次平衡在孵育结束前完成，请重新盖上盖子以防止柱体干涸，并等待反应完成。孵育结束后，向标记反应体系中加入140微升PBS，使总体积达到约200微升，并进行涡旋混匀。将溶液加至柱体中心位置，使其进入柱内。待最后一滴液体完全进入后，用550微升PBS推动溶液。当液体停止下滴时，用300微升PBS洗脱，并收集至1.5毫升微量离心管中。测定样品在280纳米以及荧光染料特异性波长处的吸光度，以计算抗体浓度和标记比率。将标记好的抗体于4摄氏度避光保存，可稳定长达六个月。用4%多聚甲醛在室温下固定视网膜类器官45分钟。固定后，在类器官上覆盖抗原修复液，将培养皿置于60摄氏度、以每分钟30转的轻微振荡条件下孵育1小时。接下来，使用含1% Triton X-100的PBS对类器官进行通透处理，在室温下轻微振荡孵育4小时。随后，在含2% BSA和0.1% Triton X-100的溶液中于室温封闭类器官，过夜或超过一天。次日，向类器官中加入稀释后的一抗，于4摄氏度轻微振荡孵育两天。用洗涤液在室温下轻微振荡洗涤类器官三次，每次15分钟。然后加入稀释后的二抗溶液，于4摄氏度轻微振荡孵育两天。按照前述方法再次洗涤类器官后，将类器官与稀释于洗涤液中的荧光染料在室温下共同孵育1小时，同时保持轻微振荡。之后再次进行洗涤。接下来，用超纯水配制15%、30%、45%、60%、75%和90%浓度的1-丙醇溶液，并用三甲胺调节各溶液pH至9.5。将样品依次置于浓度递增的1-丙醇溶液中，在30摄氏度下每步脱水2小时，同时保持轻微振荡。然后将样品转移至100% 1-丙醇溶液中，在30摄氏度下轻微振荡过夜孵育。为实现样品透明化，按1:2比例配制苯甲醇与苯甲酸苄酯混合液，制成BABB溶液。将样品浸入BABB溶液中，在室温下过夜处理。成像前更换新鲜的BABB溶液。使用玻璃移液器将类器官置于含一滴BABB的玻璃底培养皿中，确保其接触盖玻片表面。现在，使用倒置共聚焦激光扫描显微镜，结合低倍与高倍物镜，获取Z轴层扫图像以实现三维细胞分辨率。通过考虑透明化溶液与浸没介质之间折射率不匹配的问题，重新校准Z轴层扫采集的步长。启动ImageJ软件，通过选择“图像”并点击“属性”来更新体素深度，从而生成Z轴层扫图像的投影图。通过选择“图像”→“堆栈”→“正交视图”，检查Z轴层扫深度，显示视网膜类器官的XY、XZ和YZ视图。通过点击“文件”并选择“另存为”保存所需区域。最后，使用图像处理软件生成Z轴层扫三维重建图像的动画。经果糖甘油法透明化的视网膜类器官透明度提升最小，阻碍了对类器官核心区域的观察。ECI透明化方法改善了视网膜各层的可视性，但仍因持续的光散射而无法揭示类器官核心。经Fluoclear BABB透明化的类器官表现出最高的透明度，能够清晰显示皮层和核心结构，并保持一致的荧光信号。在明场图像中，ECI和Fluoclear BABB透明化处理的类器官均表现出明显的收缩现象，这是由于脱水步骤所致。BABB引起的收缩增加了样品的致密性，使得可利用高倍物镜对更深层结构进行成像。体外培养40天时，TUJ1免疫标记显示仅存在单层薄的神经元层，无明显分层结构。至90天时，细胞密集分布于顶端区域；到170天时，类器官已表现出清晰的分层组织特征，并形成明确的顶端区。在200天时，细长的细胞突起从表面向内部延伸；到250天时，类器官发育出三个明确的视网膜层。随着成熟过程，神经纤维从类器官中心向外周延伸，在体外培养250天时变得更为粗壮且结构复杂。表达蓝光和绿光/红光视蛋白的视锥光感受器在晚期出现，呈现细长形态并具有明亮的末端。视杆光感受器通过其中央分布的细胞核及周边的视蛋白分布得以识别。Chx10阳性细胞最初广泛分布，但在类器官成熟过程中逐渐特异性定位于内核层。经BABB透明化处理后，内源性GCaMP6s的表达得以保留，长期固定后仍可在神经视网膜中检测到GFP信号。