使用拟南芥莲座叶分离与分析叶表面及质外体RNA的逐步指南

我们正致力于研究植物如何调控其微生物组，以及植物分泌的RNA是否调控定植于植物上的原核和真核微生物的基因表达。我们结合高分辨率壳层电泳与基于Illumina的分析方法，检测叶片表面存在的RNA及其在生物胁迫条件下的变化。尽管近期研究表明胞外RNA可被真菌和细菌病原体吸收，但RNA吸收的潜在机制及其吸收后的功能影响在很大程度上仍待探索。

首先，为每个重复组选取六至七周龄的拟南芥植株。在开始分离叶片表面洗涤液之前，向无菌的 VIB 溶液中加入 Silwet L-77。然后使用量筒将 100 毫升配制好的 VIB 溶液转移至一个 500 毫升的喷雾瓶中。

使用精细的剪刀，小心地将拟南芥莲座叶从根部分离。随后，用软毛刷轻轻刷去花瓣上多余的土壤。将分离的莲座叶放置在平坦的托盘上，使其远轴面朝上。

然后使用装有VIB和润湿剂的喷雾瓶，向叶片的远轴面喷洒五次。小心地将莲座叶翻转过来，喷洒近轴面。通过在注射器颈部缠绕Parafilm，使其底部带孔，并将针头悬于瓶底上方，以制备改良的注射器。

为回收叶片表面冲洗液，将喷过缓冲液的莲座叶轻轻插入置于250毫升离心管内的无针头60毫升改良注射器中，并向注射器内用力喷入两下缓冲液。随后将装有样品的离心管在4摄氏度条件下以100 ×g离心10分钟。接着将回收的叶片表面冲洗液通过0.22微米注射器滤器过滤，并将滤液收集至预置冰上的50毫升离心管中。

对于叶片表面拭子法，将离体的莲座叶按照前述步骤相同的方式喷洒VIB和润湿剂溶液。为回收叶片表面的拭子样本，使用无菌棉签擦拭莲座叶的上表面（近轴面）和下表面（远轴面）。然后将吸有液体的棉签头紧贴15毫升离心管内壁挤压，以挤出液体。

将提取的叶片表面拭子样品通过0.22微米注射器滤器过滤至置于冰上的2毫升离心管中。将之前用于叶片表面冲洗或拭子分离的同一组植物放入洁净的烧杯中，用蒸馏水轻轻冲洗两次。为了用VIB对莲座叶进行真空渗透，将冲洗后的莲座叶小心放入含有300至500毫升VIB的法式压滤壶中。

盖紧盖子，轻轻下压压杆，直至莲座叶完全浸入液体中。将法式压滤壶放入真空室，使用真空泵抽真空20秒，直至植物组织充分浸润。释放真空后，从真空室中取出法式压滤壶，并取下盖子。

将VIB倒入一个500毫升的塑料烧杯中，并取出莲座叶。然后轻轻摇动莲座叶，并将叶片在纸巾上刷拭以去除多余的缓冲液。接着使用吸水纸轻轻按压叶片表面，除去任何残留的缓冲液。

为收集无细胞洗液，将经VIB浸润的玫瑰花结插入60毫升无针注射器中，并将注射器置于250毫升离心瓶内，操作方式与之前相同。将离心瓶在4摄氏度条件下以600 G离心30分钟，加速度设置为慢速。随后，将汇集的无细胞洗液通过0.22微米注射式滤器过滤至置于冰上的15毫升离心管中。

使用丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液，在三硼酸EDTA缓冲液中制备或购买含有10%或15%聚丙烯酰胺和7摩尔尿素的微型凝胶。然后将RNA样品与2倍变性上样缓冲液混合。在65°C下加热5分钟，立即置于冰上。

现在将RNA样品加入0.5倍TBE电泳缓冲液中，在室温下以220伏电压电泳约1小时15分钟。然后用含有Cyber Gold核酸染料的0.5倍TBE溶液对凝胶染色10分钟。用蒸馏水将凝胶漂洗两次，并使用成像系统进行成像。

为了定量分析分辨出的RNA条带，使用Image J文档中“分析”和“凝胶分析”菜单下的凝胶分析方法。通过将细胞裂解液RNA溶解于无RNase和DNase的水中，制备两份技术重复的RNA标准品。为制备1.5倍浓度的Cyber Gold核酸凝胶染料，将其溶解于pH为8的500毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液中。

在微孔板设置过程中，向每个孔中加入99微升蒸馏水。接着，向每个孔中加入1微升RNA，RNA样品和标准品的加样体积应保持一致。最后，向每个孔中加入50微升Cyber Gold溶液。

设置酶标仪参数时，选择线性或轨道振荡模式，持续三秒。将酶标仪设为荧光终点检测模式，激发波长为 496 纳米，发射波长为 540 纳米。利用RNA标准品的荧光强度值绘制标准曲线。

变性RNA凝胶分析显示，叶片表面冲洗液和无细胞冲洗液样品均含有多种大小的RNA，包括长链和小分子RNA。在归一化至植物鲜重后，从无细胞冲洗液和叶片表面冲洗液中分离得到的总RNA量相似。叶片表面冲洗液、无细胞冲洗液和细胞裂解液的RNA谱图存在显著差异，表明细胞内RNA污染极少，并显示无细胞RNA经过高度加工，出现弥散的低分子量条带。在囊泡分离缓冲液中添加0.001% Silwet L-77后，与不含润湿剂的缓冲液相比，叶片表面RNA得率几乎增加了一倍。

但将浓度提高至0.01%并未进一步提高RNA回收率。对相同叶片进行第二次洗涤，回收的RNA量约为第一次洗涤所得RNA的63%，表明RNA持续分泌至叶片表面。采用基于荧光的微量板检测法进行RNA定量，结果显示，无论是Cyber Gold还是RIBO 488检测方法，RNA浓度与信号值均呈现良好的线性关系。

我们已发现，tRNA及其衍生片段（即TDRs）在细胞外RNA中尤为丰富，这可能归因于其对降解的抗性。因此，我们推测这些TDRs可能在细菌中调控基因表达。我们希望鉴定叶片表面RNA的细胞来源，并阐明该叶片表面RNase在预期的微生物相互作用背景下可能发挥的生物学功能。