一种简便的植物多聚核糖体分析方法

大家好，我是 Cecile，我在马赛的 LGBP 工作。本视频中我们将介绍一种简单的方法，用于从多种植物组织中分离多聚核糖体和单核糖体，以鉴定正在活跃翻译的 mRNA，并研究翻译调控机制。

以六天大的拟南芥幼苗为例，我们将向您展示如何分离多聚核糖体，随后提取 RNA 并分析结果。将种子播种于培养皿中，在 4°C 下放置两天，然后让植物生长六天。

收获幼苗并在液氮中研磨。称取300毫克植物粉末，加入2.4毫升多聚核糖体缓冲液。离心以收集植物碎片，将上清液加至蔗糖梯度的顶部。

超速离心梯度后，从底部到顶部连续读取OD值，收集组分。将组分分为多聚核糖体、单核糖体和上清液组分，RNA沉淀过夜。超速离心后，重悬沉淀，提取RNA用于后续分析。在进行多聚核糖体分析前数天，制备蔗糖梯度。

配制 50%、35% 和 20% 的蔗糖溶液，并置于 4 度环境中。倒入 50% 蔗糖层，于 -40 度冰箱中冷冻。

六小时后，加入35%的层，并在-40℃冰箱中冷冻过夜。倒入第一层20%的溶液并进行冷冻。在实验当天，从冰箱中取出所需数量的梯度溶液。

加入最后一层20%蔗糖溶液，并将梯度离心管置于冷室中使其解冻。准备我们 freshly collected 的植物样品。此处我们使用的是六天大的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗。

收获液氮速冻的植物材料并充分研磨。称取300毫克植物粉末。迅速加入2.4毫升新鲜多聚核糖体缓冲液，并进行匀浆处理。

将溶液移液至两个1.5毫升离心管中。离心细胞质提取物。收集上清液。

注意避免混入植物碎片，否则会影响下一步的分离效果。将上清液加到蔗糖梯度中时，注意不要破坏梯度结构。

将梯度液放入SW 41转子套管中，进行离心。为了观察多聚核糖体谱型并收集组分，我们使用一个简单的系统，该系统由一根插入梯度液中的毛细管组成，毛细管连接至紫外比色皿。

它通过蠕动泵实现自连接。紫外分光光度计持续记录梯度流经比色皿时的OD值。馏分收集器可用于收集每份2毫升的馏分。

清洗比色皿并将其放入分光光度计中。从离心管中取出密度梯度时不要扰动其结构。叶绿素必须集中在梯度的顶部。

将毛细管插入梯度液的底部。启动蠕动泵。从底部到顶部收集梯度液，并持续读取光密度（OD）。

收集2毫升的组分。此处为经典图谱的形状。RNA沉淀通过使用盐酸胍和异丙醇完成。

首先，将一份体积的盐酸胍加入50毫升离心管中，然后加入该组分。接着加入1.5份体积的异丙醇和50 µg等量的载体RNA。在-20 °C下过夜沉淀RNA。

将组分转移至40毫升超速离心管中，并用异丙醇平衡管重。离心。弃去上清液，风干沉淀。将沉淀重悬于200微升温热的TE缓冲液中。

通过经典的酚-氯仿法进一步提取RNA。此处展示的是六天龄拟南芥幼苗多聚核糖体提取物的代表性图谱。主峰对应于单核糖体，即与单个核糖体结合的mRNA。

图谱的第一部分对应多聚核糖体组分，即与多个核糖体结合的 mRNA。每个峰代表新核糖体与 mRNA 的结合。图谱的最后一部分对应所谓的上清组分，其中含有游离的核糖体亚基和 RNA。

大量60S亚基在单体核糖体峰旁边形成一个肩峰。为了评估其完整性，可将从各组分中提取的RNA在进行后续实验之前，先在经典的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。我们已使用该方案从拟南芥幼苗中分离多聚核糖体，同时也成功应用于幼嫩和衰老的莲座叶，以及本氏烟、番茄和水稻叶片，因此该方法应适用于多种植物和组织。

纯化的RNA可用于微阵列分析，以及与多聚核糖体组分相关的小RNA的鉴定。