开发一种基于LED的创新照明装置 体外 应用玫瑰红光动力疗法

我们的研究旨在开发基础性和转化性项目，以表征光动力疗法在治疗缺乏有效治疗手段的癌症中的作用。目前的实验挑战在于开发必要的技术，以推动光动力疗法从体外实验向临床应用转化，包括新型光敏剂和新型光照装置的研发。与其他技术相比，我们的实验方案采用一种低成本且自制的装置，能够更充分地照射96孔板，并维持细胞培养孵育箱内的生理条件。

首先，将培养的 HepG2 细胞从培养箱中取出，置于已预清洁的微生物安全操作台内。使用移液器将培养瓶中的培养基移除。为去除残留培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻混洗，然后小心吸去缓冲液。

然后，向细胞中加入含有0.25%胰蛋白酶和0.53毫摩尔/升EDTA的3毫升胰蛋白酶溶液，将培养物放回37摄氏度的培养箱中孵育5分钟，以使细胞脱落。5分钟后，向培养瓶中加入7毫升培养基以中和胰蛋白酶并重悬细胞。接着，将胰蛋白酶、培养基以及脱落的细胞转移至15毫升离心管中。

为了计数细胞，将20微升细胞悬液移入一支洁净的离心管中，加入20微升台盼蓝溶液。混匀后，将染色后的混合液加载到计数板上，并将其插入细胞计数仪中。接着，向离心管中加入培养基，然后加入细胞，使其最终浓度达到每毫升150,000个细胞。

每孔接种1.5 × 10⁴个细胞至白色96孔板中，孔板底部需透明且平整。每次检测细胞活力时，需准备两块96孔板。接种后，将96孔板置于培养箱中孵育24小时，以使细胞充分贴壁。

配制玫瑰红B储备液时，将其溶解于10%生理盐水中。用细胞培养基将玫瑰红B处理液稀释至浓度范围为0至100 µM。随后，从细胞培养板中移除培养基，并向每孔加入100 µL已配制好的玫瑰红B处理液。

将细胞与玫瑰红B共同孵育2小时，以使其内化。2小时后，从每个孔中移除玫瑰红B溶液，用PBS洗涤细胞两次，吸去PBS，并向每孔中加入100 µL不含玫瑰红B的培养基。用铝箔包裹微孔板以避光，将其中一半的微孔板留置备用，用于光动力治疗实验中的光照处理。

将光分配器上的公头连接器连接到光源的母头连接器。从培养箱中取出光动力治疗和避光条件的微孔板。拆开光动力治疗板的包装。

然后，将LED驱动器的调光器调至最大级别，使96个孔的平均辐照度达到0.62毫瓦每平方厘米。接着，将微孔板放置在光分布器上，照射微孔板直至细胞获得预期的光剂量。

当达到所需光剂量后，关闭设备。将光动力治疗微孔板重新用铝箔包裹，并与对照板一同放回培养箱，直至进行活力检测。完成光动力治疗实验后，将照射后的微孔板置于培养箱中孵育24小时，以允许细胞产生治疗后的应答反应。

孵育结束后，取出一个经光照和一个未经光照的培养板。向每个孔中加入100 µL细胞活力检测试剂盒中的试剂，以检测线粒体代谢和ATP生成。将培养板在避光条件下孵育10分钟，随后进行发光检测。

孵育10分钟后，使用多功能酶标仪读取每孔的发光值。将未处理对照孔的发光值视为100%活力。将处理孔的发光值相对于该对照进行归一化，以计算每种处理条件下的细胞活力百分比。

在其他处理后时间点（如 24 小时、48 小时和 72 小时）重复相同的细胞活力检测方案。单独光照（无玫瑰红）在所有测试的光剂量下均未改变 HepG2 细胞的活力，单独使用玫瑰红（无光照）在所有浓度下也未引起显著变化。使用 CELL-LED-550/3 进行的玫瑰红介导的光动力治疗在所有光剂量下均显著降低了 HepG2 细胞的活力，显示出强烈的细胞毒性作用。

LED发射光谱与玫瑰红B的吸收光谱之间的重叠证实了CELL-LED-550/3设备与该光敏剂在光谱上的兼容性。未来，我们的主要目标之一是开发新型光动力治疗（PDT）套装，每套均包含能够特异性靶向癌细胞的光敏化合物以及配套的照射装置。