利用靶向富集工作流程从临床样本生成完整的细菌基因组

基因组可提供有关病原体的祖先、传播及功能的信息。对于不可培养的细菌，这些信息只能通过靶向富集获得。由于人类DNA含量极高、微生物群落复杂以及细菌载量极低，直接从临床样本中测序细菌病原体具有挑战性。

在许多情况下，由于采样方法和苛养细菌的限制，培养并非可行选择。在将该技术应用于性传播细菌时，我们发现了一种新型的沙眼衣原体LGV谱系，命名为ompA基因型L4，并证实了优势LGV谱系的全球扩散，为分子诊断和流行病学监测提供了关键见解。该富集流程可从确诊阳性的性传播感染临床样本中实现完整基因组的回收。

我们发现，该技术在性能上优于宏基因组深度测序、宿主DNA耗竭以及纳米孔自适应测序。我们正在调查这些病原体在欧洲及阿根廷的流行毒株。该研究有望为传播机制和抗菌药物管理提供重要信息。

首先，使用一种灵敏且准确的基于荧光的方法测定临床样本DNA提取物的DNA浓度。用无核酸酶水将每个DNA样本稀释，使最终体积为17微升的PCR管条中含10至200纳克DNA。向每孔中加入17微升稀释DNA后，再向各孔加入3微升片段化预混液。

上下吹打20次以充分混匀。然后密封PCR管条，高速涡旋振荡10秒，并短暂离心以收集管壁液体。

然后，将 PCR 管条放入热循环仪中，并启动预先设定的片段化与孵育程序。接着，按照表格所示配制末端修复与 dA 加尾主混合液。涡旋振荡并离心管子（操作方式同前），然后置于冰上保存。

然后，将20微升末端修复和dA加尾主混合液加入每个含有50微升DNA片段的孔中。密封条板后，高速涡旋振荡8秒。短暂离心条板后，将其放回热循环仪中。

当热循环程序结束后，将PCR管条置于冰上。接着，向每孔含有DNA片段的反应孔中加入25 µL室温连接主混合液（该混合液需提前30至45分钟配制）。对于带有NBC标签的文库，向每孔加入5 µL接头寡核苷酸混合液。

立即将PCR管条放回热循环仪中，并继续运行程序。开始DNA纯化前，从4摄氏度取出磁珠，使其恢复至室温后再使用。然后，向每个样本孔中加入80 µL。

将PCR管条置于磁力架上，每孔用200微升70%乙醇洗涤两次。每次洗涤时静置一分钟，并小心移除乙醇，避免扰动磁珠。加入35微升无核酸酶水与磁珠混匀后孵育5分钟，随后小心吸取各孔上清液，转移至新的PCR管条中对应的孔内。

将新的PCR管条置于冰上，并弃去磁珠。取准备好的预捕获PCR反应混合液，向每孔含有纯化DNA文库的样本中加入11微升。向每个反应中加入5微升选定的index引物修复液，并密封PCR管条。

按照表格中指定的程序启动热循环仪以进行捕获前PCR扩增。只有当热循环仪温度达到98摄氏度时，才加入PCR管条。完成捕获前PCR后，进行另一次基于磁珠的纯化步骤，以纯化文库。

将PCR产物与磁珠孵育。然后，将PCR条状管置于磁力分离装置上，静置5至10分钟，直至溶液变澄清。在条状管仍置于磁力架上的同时，小心移除并弃去每个孔中的澄清上清液。

然后，用 15 微升无核酸酶的水洗脱 DNA，并测定纯化后 DNA 文库的浓度。进行样品杂交时，根据此处指定的方案设置热循环仪程序。启动程序后立即暂停运行。

使用无核酸酶水将制备好的DNA文库稀释至终体积为12微升，DNA用量为500至1,000纳克。将寡核苷酸阻断剂混合物涡旋振荡并离心后，向每个样本管中加入5微升。密封PCR管条，置于热循环仪中。

当热循环仪运行至程序第三步时暂停。将13微升已准备好的室温探针杂交混合液加入每个样本中，同时保持八联管仍在热循环仪内。缓慢吹打8到10次以充分混匀。

确保无气泡存在，将条带放回热循环仪中。然后确认所有管盖均已紧密密封。为捕获杂交文库，将每管中的全部液体转移至相应含有200 µL预洗的链霉亲和素磁珠的管中。

在用室温洗涤缓冲液洗涤前，先收集链霉亲和素磁珠。将PCR条状管从磁力架上取下后，加入200 µL预热至70 °C的高温洗涤缓冲液，通过上下吹打重悬磁珠。密封管条，高速涡旋振荡，并像之前所示那样快速离心。

将密封的试管条置于70摄氏度的PCR仪金属块中，孵育5分钟。将PCR试管条从PCR仪转移回室温下的磁力架。静置1分钟，直至溶液变澄清。

然后，小心移除并弃去上清液。接着，向每根含有磁珠的试管中加入 25 µL 无核酸酶水。按照此处所示表格中的要求设置热循环仪程序。

向每个样品管中加入25 µL制备好的捕获后PCR反应混合液。轻轻混匀反应液，直至悬浮液均匀，然后牢固密封PCR管条，无需离心。将密封好的PCR管条放入热循环仪中。

将PCR产物转移至新离心管后，向每个样本管中加入50微升磁珠悬浮液，并按照之前所示方法进行DNA纯化。使用基于荧光的定量方法测定最终纯化文库DNA的浓度。靶向富集导致所有检测病原体（包括沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和生殖支原体）的靶上读段比例显著升高，因而相较于直接测序可获得更完整的基因组。

基因组测序的成功主要出现在针对全部四种病原体的qPCR循环阈值（CT值）低于30的样本中。沙眼衣原体的CT值与靶向读段百分比之间呈现出明显的负相关关系。相较于先前使用的65摄氏度，采用62.5摄氏度的杂交温度可提高生殖支原体的基因组覆盖度，同时不影响其他目标病原体的检测性能。

对来自阿根廷的沙眼衣原体基因组进行系统发育分析，结果显示许多样本聚集在L2b分支内，并发现了一个新的谱系，该谱系被提议为ompA基因型L4，与此前所有LGV基因组相差约600个单核苷酸多态性位点。