利用全基因组测序对源自罗非鱼（Oreochromis spp.）养殖场的一种致病性Escherichia coli菌株进行表征

全基因组测序（WGS）可通过基因组分析及鉴定介导抗菌耐药表型的分子机制，从而帮助解答抗菌耐药领域的关键问题。全基因组测序极大地推动了DNA，尤其是细菌DNA的大规模研究，能够在单次测序运行中深入表征微生物，包括亲缘关系密切的致病变异株。新一代测序技术可快速鉴定微生物及其抗菌耐药特征，被视为临床环境中用于病原体诊断、治疗、监测及溯源的重要工具。

下一代测序技术不仅在临床环境中，而且在环境监测以及食品安全领域，对病原体的监测和溯源均能发挥决定性作用。目前，该技术尚未成为常规方法。实际上，了解实验流程的每个步骤将有助于更好地理解实验成功的关键所在。

演示该实验步骤的是我们研究团队的基因组学技术员 Julissa Enciso-Ibarra。在提取并定量细菌 DNA 后，向其中加入 2.5 微升片段化缓冲液。取 2 微升输入的基因组 DNA 置于 0.2 毫升离心管中，并用移液器吹打混匀。

加入一微升扩增缓冲液，用移液器吹打混匀。然后在280 ×g离心一分钟。将样品置于55摄氏度的PCR仪中反应五分钟，随后在10摄氏度下保存。

向样本管中加入一微升中和缓冲液，通过移液轻轻混匀。离心管子后，在室温下孵育五分钟。接着，每种index接头各加入1.7微升，并加入三微升indexing PCR预混液。

混合组分后，在室温下以280 G离心一分钟。将样品放入热循环仪中，按照文中的描述进行第二次PCR反应。现在通过涡旋振荡充分混匀商用磁珠溶液。

根据制造商的说明，将已进行标签化或加接头的基因组DNA样本转移至一个新的5 mL离心管中，并为基因组DNA样本每微升终体积加入0.6 µL磁珠。使用移液器轻轻混匀各组分，在室温下孵育5分钟。

将样本管置于磁力架上静置两分钟，直至上清液澄清。小心弃去上清液，避免扰动磁珠。然后加入200 µL新鲜配制的80%乙醇，不要混匀。

孵育30秒，直至洗脱液变澄清，小心移除上清液，避免扰动磁珠。重复此步骤，并将磁珠室温晾干10分钟。随后向磁珠中加入15 µL 10 mmol/L Tris缓冲液，轻轻吹打混匀，室温孵育2分钟。

将样本管置于磁力架上静置两分钟，使上清液澄清。随后，小心地将14 µL上清液从样本管转移至新的0.2 mL离心管中，获得纯化后的文库。按照生产商说明书解冻试剂盒。

取5 µL标准化文库加入低吸附的1.5 mL离心管中，用适当体积的RSB缓冲液将混合文库稀释至4 nmol/L。然后，在新的低吸附1.5 mL离心管中，分别加入5 µL混合文库和5 µL 0.2 N氢氧化钠溶液。为将混合文库变性为单链，通过涡旋震荡混匀该离心管。

离心1分钟，室温孵育5分钟。随后，将10微升变性混合文库加入990微升预冷的杂交缓冲液中，用移液器轻轻混匀。将离心管置于冰上，直至进行上机测序前的最终稀释步骤。

通过混合2微升对照文库和3微升无核酸酶水，制备浓度为4纳摩尔的对照文库。然后分别加入5微升对照文库和5微升 freshly prepared 0.2 N 氢氧化钠。按照之前的方法将对照文库变性为单链。

用移液器轻轻混合10微升变性对照文库和990微升预冷的杂交缓冲液，混匀后置于冰上，直至完成测序仪上机前的最终稀释。在新的低吸附1.5毫升离心管中，加入594微升变性混合文库和6微升变性对照文库。充分混匀后，用预冷的杂交缓冲液将最终文库混合物稀释至600微升，使上机浓度为1.2 pM。

在将最终文库混合物上样至试剂盒之前，需进行额外的热预处理，以实现文库高效加载到流动池中。将最终文库混合物在96摄氏度孵育两分钟。颠倒离心管以混匀，随后将离心管置于冰上放置五分钟。

将500微升最终文库混合物加入试剂盒上的指定储液池中。启动测序仪后，加载试剂盒、芯片，并设置测序运行。进行数据分析时，连接至测序数据服务器并下载FASTQ文件。

使用第三方软件评估原始测序数据的初始质量。从原始测序数据中去除残留的接头序列、低质量碱基和短读段。使用第三方软件将经过质量检查的测序数据组装至重叠群（contig）或支架（scaffold）水平。

通过将包含组装基因组的Phaster文件提交至RAST服务器，进行基因组注释。将Phaster文件上传至基因组流行病学中心和Claremont分型网络平台，以鉴定流行病学特征，包括抗生素抗性基因（ARGS）、毒力相关基因（VAGS）以及质粒。

将 Phaster 文件上传至 Phaster 服务器，以鉴定前噬菌体序列。基因组注释揭示了 5,633 个编码特征，其中 5,524 个为蛋白质编码基因，109 个为与 RNA 相关的序列。预测的 Escherichia coli 菌株属于 B1 谱系群，序列型为 40。

一种抗菌药物耐药决定因子——编码广谱多药外排泵的 M D F A 基因被鉴定出来。同时还鉴定了编码耐热肠毒素、血清抗性蛋白以及III型分泌系统及其分泌效应蛋白的基因。这些编码序列被归类为称为子系统（subsystems）的功能相关蛋白质集合，特别是那些在碳水化合物、蛋白质、氨基酸及其衍生物代谢以及膜转运中发挥功能作用的蛋白质。

在整个实验流程中，良好的实验室规范至关重要。然而，在进行分段 DNA 文库构建并处理多个样本时，必须格外注意避免交叉污染。