利用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具及自动化图像分析定量活细胞中核质运输动态

我们的实验室研究核孔和染色质组织之间的相互作用。因此，我们研究核孔如何影响染色质组织，但反过来研究染色质组织是否影响核孔功能，特别是在核质运输中。核质转运是一个非常快的过程，因此一项挑战是检测活细胞中核质转运动力学的变化。

没有很多工具可用于监测活细胞中的核质转运。通过实施半自动化和改进的技术，我们希望促进这些工具的使用。我们的协议基于深度学习。

它限制了误差并大大减少了分析所需的时间。以前需要一天的时间现在只需要一两个小时。首先，在计算机系统上启动 FIJI 软件。

选择稳定阶段作为图像一，照明阶段作为图像二，选择恢复阶段作为图像三。将代表三个阶段的三个图像连接起来以生成单个图像。通过导航到文件并选择另存为 TIFF 来保存获取的合并图像以进行分割。

接下来，通过选择图像、颜色和拆分通道来拆分 mCherry 通道。然后通过转到文件、另存为和 TIFF 保存分割图像。要在采集过程中检查漂白情况，请依次选择图像、堆栈和绘图 Z 轴轮廓。

然后单击“数据”，然后单击“复制第一个数据集”，并将其粘贴到提供的电子表格中，在 Z 轴配置文件单元格下。现在，通过单击“分析”，然后单击“工具”，然后单击“ROI 管理器”，绘制一个圆形感兴趣区域，近似原子核的平均大小。添加投资回报率并通过导航到“更多”并单击“保存”来保存。

在延时期间将保存的 ROI 放置在无细胞区域。确保在分析和设置测量值下选择了平均灰度值“。然后单击更多、多度量。

选中“测量所有 50 个切片”和“每个切片一个 ROI”，然后单击“确定”记录强度。将所有测量的强度值复制并粘贴到 ROI 背景单元格下提供的电子表格中。然后关闭仅包含 mCherry 通道的图像，并选择具有合并通道的已保存图像。

现在，通过依次单击 插件、跟踪和 TrackMate 来打开 TrackMate 插件。确认时间点范围从 0 到 49，然后单击下一步。选择 StarDist 检测器，然后单击下一步。

选择通道二，SiR-DNA，进行细胞核分割，并等待该过程完成。在阈值设置窗口中保留默认参数，然后单击下一步。使用平均强度、通道一创建滤波器，以排除具有极端信号值的原子核。

创建一个过滤器以选择高于定义阈值的值，创建另一个过滤器以选择低于阈值的值。同样，添加两个区域过滤器以去除碎片或垂死的细胞，然后单击下一步。选择 Simple LAP 跟踪链接，然后点击下一步。

接下来，调整跟踪参数。将“连接最大距离”设置为 30 微米，将“间隙闭合最大距离”设置为 15 微米，将间隙闭合最大框架间隙“设置为 3。然后单击下一步。

计算完成后，单击“下一步”以设置轨道上的过滤器。要仅选择在整个时间过程中跟踪的原子核，请选择轨迹中最多的点数，然后单击下一步。然后勾选“显示点名称”以在进一步分析中回溯每个细胞核，并根据需要自定义其他显示功能。

在页面底部，单击“曲目”并选择“导出为 CSV”以保存测量表。关闭表格并单击下一步继续。现在单击“捕获叠加”作为作，然后按“执行”，然后按“确定”生成带有跟踪细胞核的图像。

通过依次单击“文件”、“另存为”并选择 TIFF 来保存图像。要将 TrackMate CSV 文件导入到提供的电子表格中，请单击“数据”选项卡。在“获取转换数据”组下，单击“从文本/CSV”，然后单击“导入”。

复制 Spot IDB、Track IDC、Frame I 和平均强度通道 1M 列，并粘贴到所提供电子表格的 A 至 D 列中。首先按单元格 B5 中的轨道 ID、单个细胞核，然后从单元格 C5 中按帧、时间点对结果的字母顺序排序。现在打开 GraphPad Prism，创建一个新工作表，然后从电子表格中复制粘贴时间列。然后将获得的相对核强度值粘贴到 GraphPad Prism 表中。

要生成相对核强度图，请导航到“图形”部分，然后选择“XY”作为图形族。然后选择“点和带误差线的连接线”作为图形类型。在绘图设置中，选择“均值和误差”和“SEM”，然后单击“确定”。接下来，要获取导出速率，请单击新建数据表并仅输入稳定阶段和照明阶段的小数点时间。

将获得的这些相的相对核强度值粘贴到表格中。在“结果”部分中，单击“XY 分析”，然后单击“指数”。然后选择非线性回归并单击确定。在参数下选择“Plateau followed then a phase decay”作为模型。

然后选择一个等于 2.25 的常数作为 X0，一个等于 1 的常数作为 Y0，以及一个等于零的常数作为平台。指示 K 应大于零，然后按确定。创建一个新表并粘贴转置获得的 K 值。在“图形”部分中，选择“列”作为图形族，然后选择小提琴图作为图形类型。

选择“显示所有点”作为绘图，然后单击“确定”。在活细胞成像中可视化了光遗传学探针lexy的核输出。在甲醇处理细胞的对照条件下，蓝光照射后核mCherry强度急剧下降，随后在照射后阶段逐渐恢复。用输出抑制剂钩霉素 B 处理导致核输出发生变化，因为探针信号在所有时间点始终保持核状态。

相对核强度的定量分析显示，随着时间的推移，核强度缓慢下降，直到在照明阶段结束时达到平台期。中间钩霉素 B 浓度应显示出温和的核输出。根据强度数据计算的输出率证实，甲醇处理细胞的输出率显着更高，0.5 纳摩尔钩霉素 B 的输出率要低得多，并且 1 纳摩尔钩霉素 B 几乎没有出口。