在活体Caenorhabditis elegans中通过荧光显微镜优化内源性货物轴突运输的可视化

传统研究通常使用荧光标记的完整蛋白质来可视化外显子运输，但内源性货物的行为有所不同。内源性蛋白质的表达水平较低，使得可视化变得困难。我们提出了一些优化成像条件的建议，以更好地可视化标记突触小泡前体的内源性GFP Rab-3。

轴突运输领域中细胞质蛋白的丰度较高，使得利用传统荧光显微镜观察其动态过程变得困难。本方案建议结合消融步骤与时间可控的标记方法，以克服这些挑战。我们近期已通过优化本方案中所述的采集参数，并结合时间可控标记技术，成功实现了对内源性谱蛋白轴突运输的可视化。

这使我们能够鉴定出介导运输过程的机械装置的最初组分。首先，取出培养在细菌菌苔上的秀丽隐杆线虫的线虫生长培养基平板。使用铂金丝挑取线虫，将其转移至一滴0.5毫摩尔的左旋咪唑溶液中，并孵育20分钟。

用移液器将12微升M9培养基滴加到载玻片上的10%琼脂糖凝胶区域。使用毛发挑取器，从左旋咪唑液滴中转移10至20条线虫至琼脂糖凝胶区域的M9液滴中。在液滴上放置盖玻片，并将其旋转45度，以观察DA-9轴突中的运输过程。

随后，用粘稠的胶状凡士林密封盖玻片与载玻片之间的缝隙。首先，取已制备好的秀丽隐杆线虫成像载玻片，在4倍至20倍物镜下观察，以定位线虫。

记住它们的位置，然后切换至63倍放大镜进行详细成像。采集初始图像以评估采集参数。通过强度直方图监测信号强度，并在必要时增加激发激光强度。

接下来，使用488纳米激光漂白待分析的轴突区域。比较漂白前后信号强度，以确定漂白效率。采用2×2像素合并以增强单个运输事件的信号强度。

延长曝光时间，并在连续的时间点之间采用 300 至 700 毫秒的时间分辨率，以追踪 RAB-3 的运输事件。根据信号强度和运输事件的频率，记录时长为一至三分钟的时间序列图像。首先，在活体秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）DA-9 轴突的非突触区域，对内源性 GFP 标记的 RAB-3 进行延时成像记录。

将延时成像数据文件导入 Fiji。然后，检查在图像采集过程中动物或轴突片段是否存在移动或轻微漂移。使用 StackReg 插件的刚体变换选项来校正任何移动或漂移。

使用分段线工具，并调整线宽以匹配轴突直径。用鼠标左键双击分段线图标，沿轴突片段绘制一条用于分析的线。然后使用 Fiji 插件 KymoReslice Wide，在其参数设置中将线宽方向上的最大强度值设为参数，生成图谱。

使用直线工具在时空图中追踪运输事件。分别追踪单个运输事件，并将每条直线保存至 ROI 管理器。在 Fiji 中选择测量参数，如面积、边界矩形、平均灰度值和费雷特直径。

然后，将结果表粘贴到电子表格中进行计算。将宽度乘以相机的分辨率，得到以微米为单位的运行长度。为了确定运动事件的持续时间，将高度乘以连续时间点之间的采集时间。

将暂停时间计算为连续两次运动之间速度为零的运行持续时间。将事件总数归一化为每分钟单位轴突长度片段的kymograph总长度，以获得单位时间单位长度的事件数。使用Feret角度工具，将事件分类为顺向运输和逆向运输。

对于通过从近端到远端绘制分段线生成的明场图像，使用Feret角来确定每个事件的方向性。