可定制于不同发育阶段的可扩展脑基质的制备

由肯塔基州列克星敦市肯塔基大学的 Chapman 及其同事开发的一种可扩展且可针对不同发育阶段进行定制的大脑基质。仔猪大脑的发育在多个方面与人类大脑非常相似。与大鼠和小鼠相比，仔猪从出生到成年期间大脑重量的增长比例与人类更为接近，且仔猪与人类大脑的脑回及大脑功能区域也极为相似。

由于这些原因，猪和其他大型哺乳动物在神经科学研究中的使用正在增加。然而，适用于大型哺乳动物的商用脑切片矩阵价格昂贵，且通常仅提供单一尺寸或切面选择。因此，商用切片矩阵可能无法很好地适配不同品系、雌雄个体以及不同年龄的动物。

这对于发育神经科学研究而言尤为棘手，因为在出生后的生长过程中，脑容量会发生显著变化。例如，仔猪大脑在出生后的前三个月内迅速发育，体积增加超过三倍。而现有的商用仔猪脑矩阵仅适用于两周龄以内的仔猪大脑。

本文介绍一种基于亚克力板的可定制矩阵构建方法，作为解决该问题的一种经济高效且易于实施的方案。本实验共获取四头未经处理的四日龄猪，其中一头用于五日龄时脑组织采集，两头用于32日龄时采集，另一头用于38日龄时采集。

将脑组织从颅骨中取出后，将其浸入10%缓冲福尔马林溶液中固定两天，随后置于30%蔗糖溶液中五天以进行冷冻保护。接下来我们将介绍如何使用琼脂糖凝胶制作脑组织的铸型。制备基质的第一步是制作脑组织的模具。

我们将演示制作出生后第五天仔猪脑组织模具的过程，该模具将用于构建矢状面切片矩阵。在玻璃容器底部放置一条重型塑料条，确保塑料条两端伸出容器边缘。该塑料条将有助于更轻松地取出琼脂糖凝胶块。

将容器约一半浸入装有湿冰的桶中。在玻璃烧杯中，将150毫升磷酸盐缓冲液（PBS）加热至90摄氏度，并加入6克琼脂糖，持续搅拌。缓慢倒入4%琼脂糖溶液，在容器底部形成0.5至1厘米厚的薄层，静置使其凝固。

用一层薄薄的矿物油完全包裹脑组织，以防止琼脂糖与脑表面结合或滞留在脑沟内。油层还可使脑组织从琼脂糖凝胶中更易于取出。包裹完成后，将脑组织置于琼脂糖薄层上，根据冠状或矢状模具的需要，以尽可能平直和直立的方向摆放。

在持续搅拌下，使琼脂糖溶液冷却至 50 摄氏度，以保持可倾倒的黏度。然后将琼脂糖溶液倒在脑组织上，直至完全包埋。在室温下静置，使琼脂糖完全凝固。

使用手术探针沿脑组织轮廓切割其上方的琼脂糖层。当脑组织周围的切割完成后，用一把薄刮铲轻轻抬起并移除上层琼脂糖。在这些操作步骤中，注意避免切伤或划伤脑组织。

轻轻将整个大脑从模具中取出。由于之前已在表面涂抹了石蜡油，脑组织应能较容易地脱模。务必清除可能掉入印模中的微小琼脂糖凝胶碎片。

将98毫升PBS加入烧杯中，加热至9摄氏度，加入4克琼脂糖和2毫升印度墨水，充分搅拌。将此黑色琼脂糖溶液倒入脑组织形成的印模中，注意不要溢出印模。

让黑色凝胶凝固。握住塑料条的两端，将整个琼脂糖块从容器中取出。接下来我们将演示如何为您的矩阵制作模板板。

切割脑组织模具时，将一张刻度纸置于两块76毫米透明亚克力板之间，并将其靠近桌边放置。然后使用夹具固定四个金属角片和两块亚克力板的四角，以构建两个侧壁，从而紧密固定琼脂糖块并保持其理想方向。两个金属角片的前边缘以及两块垂直亚克力板的前边缘应与刻度纸的一侧对齐。

将琼脂糖凝胶块放置在标尺纸上，使其待切割的边缘与标尺纸上的刻度以及垂直丙烯酸板和角块的边缘对齐，并在琼脂糖块的对侧放置一个重物以固定其位置。修剪掉凝胶块多余的边缘，直至接近印度墨水脑铸型但尚未切割。借助下方标尺纸上的刻度标记，以所需的步进距离（例如2毫米或5毫米）向前移动琼脂糖凝胶块。

用双手牢固握住刀片，沿着两块亚克力板的前缘及角块的边缘向下移动，以切割样品块。将每一片切片放置在另一张称量纸上，用力按压，使切片的印迹转移到纸上。用笔勾勒出整个切片的轮廓。

取下切片，用墨汁勾勒出脑轮廓。在标尺纸上注明第一张切片的方向，例如矢状切面的后端和前端，并在后续将其他凝胶切片添加到纸张上时保持方向一致。对每张描图依次编号。

将亚克力板切割成10厘米×8.5厘米的尺寸。然后将它们叠放，并使用角尺和夹具固定在钻床的工作台上。根据文稿中指示的坐标，通过叠层钻出三个孔。

移除亚克力板上的保护膜。然后将一块亚克力板覆盖在方格纸上的模板上，使亚克力板的上边缘与模板的上边缘对齐。用永久性记号笔将脑轮廓描画到亚克力板上。

使用标签标记每块板材，使其编号与模板或脑部轮廓图的编号相对应。使用带锯沿复制的模板线条切割每块板材。或者，也可使用装有木雕钻头的旋转工具去除不需要的区域。

使用带有抛光砂磨头的旋转工具修整切割边缘，以磨平边缘，因为锋利的边缘可能在切片过程中损伤脑组织。通过将亚克力板放在模板上来重新检查切割的准确性。根据需要进行修剪和抛光。

接下来，我们将演示如何组装这些板。通过按顺序堆叠板来预组装矩阵，并检查板的对齐情况。矩阵组装首先将三根长的不锈钢螺栓穿过第一块丙烯酸板，然后在每根螺栓上放置一个垫圈。

放置第二块板，并在每个螺钉上添加垫圈。或者，也可以使用强力胶将垫圈粘在固定孔周围，以避免每次组装时单独添加垫圈。重复此过程，直至所有板依次安装到螺栓上。

用螺母将每个螺栓固定，使所有部件紧密连接。对朝向脑组织的边缘进行最后抛光，以实现板与板之间更平滑的过渡。使用不同颜色的记号笔，以交替颜色标记亚克力板的上边缘，以便于切片操作。

此处我们交替放置黑色、红色和无标记的切片板。最后，我们将演示在冠状面或矢状面切取脑组织的步骤。进行脑切片时，需将脑组织以与制模过程中相同的方向并尽可能端正地放入切片矩阵中。

您需要使用宽而扁平的刀片来切割脑组织。宽刀片可减少切片过程中发生扭转或弯曲的风险。我们推荐使用高轮廓的冷冻切片机刀片。

出于安全考虑，用实验室胶带包裹刀片一端约两厘米的长度，以在切片脑组织时安全持握包裹部分。此处需注意：由于脑组织各区域在福尔马林固定后具有不同的质地，操作时应小心，对刀片施加均匀的压力。

此外，仔猪脑体积较大，因此切割脑组织时宜采用切片动作，而非直接向下按压切割。应以均匀力度将刀片从一侧拉向另一侧，确保切割深度足以完全切穿整个脑组织。将所有脑片置于盛有PBS的六孔板或不锈钢托盘中。

小心地将脑片放入托盘中，保持切片的顺序和方向，并根据需要进行保存或后续处理。为了调整几何形状或扩大腔体以更好地适配脑组织，可选择性地移除或添加丙烯酸板，使切片矩阵适应不同大小的脑组织。此处我们以一个为P5仔猪脑设计的矢状切片矩阵为例，通过在矩阵中部添加若干块丙烯酸板（图中以蓝色和绿色标示）来实现扩容。

现在该模具已适用于对一只P38仔猪进行矢状切片。通过扩大或缩小模具尺寸，可显著提高其灵活性，同时节省材料和人力。与冠状切片相同，使用连续的切片板引导刀片，沿矢状面仔细切割脑组织。

颜色编码系统有助于识别刀片的正确顺序位置，这在切片较薄时尤为困难。将脑组织从矩阵中取出，并轻轻分离切片。总之，我们开发了一种简便、经济且灵活的方法，用于制备新生仔猪的脑组织矩阵。

该概念可应用于较年长的猪及其他大型动物模型。