一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

我们的研究聚焦于连接组学。我们开发了高通量的光学或电子图像采集方法，以实现对神经回路及其突触连接特征的分析，从而破译神经回路的基本连接逻辑。传统的高分辨率连接组学由于数据采集成本高昂且精度要求高，仅限于小体积脑组织；而快速显微分析和靶向显微研究则为全脑连接组学提供了可能。

与其他显微技术（如各种Larsens显微镜）相比，OMLIT能够捕获所有神经元的图像，并包含树突和轴突的精细结构信息。除了与电子显微镜兼容外，OMLIT在EF下还可实现进一步的纳米级分辨率成像。OMLIT有助于构建全面的大脑模型，结合连续切片技术，可同时绘制所有长程投射的路径，包括其方向、强度和类型，以及局部微环路。该技术为全脑范围内的结构架构和信息流动提供了深入见解。

我们正在开发由OMLIT定义的参考区域（RIs）引导的自动化OMLIT成像与电镜数据采集技术，以实现对大范围或全脑体积的高效连接组学数据采集与分析。首先，选择厚度为50微米的卡普顿膜（capton）或D50膜，并将其安装至电动卷绕系统上。使用双枪磁控溅射系统，在胶带表面沉积一层均匀的铬或其他金属（如铝、银或铜）超薄薄膜。

将胶带置于距离溅射靶80毫米的位置。在直流电源和由99.99%氩气调节至1帕斯卡的压力条件下进行该过程。现在，将胶带的卷绕速度设置为0.6毫米每秒，以获得50纳米的金属涂层厚度。

沉积完成后，待系统冷却至室温，取出胶带。使用探针台阶仪、原子力显微镜或扫描电子显微镜评估涂层的厚度和均匀性。对于低反射率策略，使用等离子清洗机在80瓦功率下以每秒七毫米的速度移动胶带，对其进行清洁并使其具有亲水性。

处理后，将水滴置于胶带表面，确认水滴迅速铺展成一层薄膜。使用小型研磨机或类似的切割工具，对样品侧的树脂进行粗略修整，去除周围的空白树脂，暴露出样品区域。将包埋树脂的样品块放入样品 holder 中，并拧紧以牢固固定样品块。

将样品台安装到切片机的可移动臂上。在刀架上以45度角安装玻璃刀或金刚石修块刀。在显微镜下，将样品表面修切成金字塔形状并进行修平，然后修切并平整样品块的四个侧面，以去除多余的树脂。

旋转旋钮，使块状样品的前缘和后缘处于水平位置。取下修块刀，换上以45度角放置的金刚石刀。将切片机底座的倾斜角度设为6度，然后使用旋钮缓慢移动刀架，直至刀具前缘距离样品表面1至2毫米。

观察样品表面与刀刃之间出现的亮带，并调节倾斜角度，使亮带在上下和左右方向均保持均匀。现在，将蒸馏水注入金刚石刀的槽中以润湿刀刃。用注射器吸除部分水，直至液面下降并出现银色反光。

接下来，在控制单元中设置切片厚度、切割速度和切片窗口。根据样本质量，将切片速度调整为0.6毫米每秒，切片厚度调整为60纳米。使用超薄切片机开始切片。

当产生稳定且均匀的切片后，暂停操作。然后使用细刷清除已切下的切片和碎片。现在，将涂有粘附层的胶带卷和空的收卷轴安装到自动超薄切片收集系统上。

固定锁定装置，并进行试运行，以确认胶带以恒定速度平稳移动，并能正确收卷到收卷轴上。将胶带收集装置的收集头浸入金刚石刀的水浴中，并调整收集头使其与刀刃平行，间距为样品切片长度的1.5倍。固定收集装置后继续切片，同时运行胶带收集装置。

收集到足够数量的连续切片后，暂停切片。在无切片的区域切断胶带。运行胶带收集装置，直至所有胶带完全缠绕到卷轴上。

接下来，取下线轴并将其放入电子干燥箱中。清洁胶带收集装置和切片机，并将所有附件归位。若需在硅片上进行固定，需从双面导电胶带上剥离透明保护膜。

将胶带平行于双面导电胶带贴附，每片上可放置最多三段胶带。将硅片置于光学显微镜的载物台上，并用无残留胶带固定。使用5倍物镜获取硅片、胶带及样品的概览图像。

在概览图像上勾画出每个区域并进行排序，然后添加焦点和曝光点，以在整片晶圆上以 20 或 50 倍放大倍数进行自动成像。成像完成后，保存图像并检查其质量，若发现图像失焦或质量不佳，需重新对焦并再次成像。通过选择“导入”，然后选择“从图像导入图像体积至 VSV 文件”，将 TIFF 图像序列导入 VAST 22。

连接外部平板设备，使用画笔工具和绘制分割模式，手动分割并追踪结构。使用快捷键 A 和 Z 在图像切片之间导航。接下来，选择窗口，然后选择 3D 查看器、查看并更新，以三维形式可视化已分割的结构。

最后，在选择文件并保存分割结果后完成保存操作。在高反射率图像中，细胞质和血管腔区域的强度高于周围区域；而在低反射率图像中，细胞质和血管腔区域的强度则较低。定量结果显示了高反射率与低反射率策略的效果。

在对比度和信息熵方面，每种方法均有其优势。OMLIT光学显微成像技术可识别轴突、血管、细胞体和树突。使用VAST对omelet图像进行手动分割，显示出大量紧密排列的细胞体、树突和轴突。

将分割结果与原始图像结合，生成三维可视化图像。放大的OMLIT图像显示分辨率不足，无法揭示更精细的结构。同一区域的电子显微镜图像则揭示了突触、线粒体、细胞核和囊泡。