使用荧光脂肪酸类似物定量内皮细胞脂肪酸摄取

血液中的营养物质（如脂肪酸）必须通过毛细血管内皮屏障进入代谢组织，但其机制尚不明确。阐明这些过程可能为治疗2型糖尿病等代谢性疾病揭示新的治疗靶点。因此，我们发现骨骼肌和脂肪组织均通过旁分泌代谢物调节内皮细胞对脂质的摄取和转运，这一过程也部分受到内分泌系统的调控。

我们还发现，尽管内皮细胞已知主要依赖糖酵解产生的ATP，但线粒体ATP出乎意料地参与了内皮细胞对脂肪的摄取。利用本方案中所述的检测方法，我们计划进一步探究内皮细胞脂肪酸摄取与转运的分子机制，包括其他组织可能如何调控这一过程。首先，通过将25毫升2%明胶储备液加入475毫升PBS中，配制0.1%明胶溶液。

充分混匀明胶溶液，并使用0.2微米真空滤器过滤除菌，或进行高压灭菌。用移液器向黑色透明底96孔板的每孔中加入100微升0.1%明胶溶液。将该板置于37°C培养箱中孵育至少30分钟，或过夜。

孵育后，从预包被的96孔板中移除多余的明胶溶液，用PBS洗涤一次。然后，使用能够使细胞在次日达到汇合的接种密度，每孔加入100微升细胞悬液。

配制3-羟基异丁酸和乳酸的20毫摩尔溶液作为阳性对照。阴性对照使用1微摩尔的硝氯酚胺。然后将上述溶液加入到另一个96孔板中。

用预热的无二价阳离子 PBS 洗涤内皮细胞一次，移液时保持较大倾斜角度，以避免扰动已贴壁的细胞。每孔加入 50 µL 相应的处理试剂，将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟或 60 分钟。制备 BODIPY 脂肪酸-BSA 复合物时，将 2 µM 的 BODIPY 脂肪酸溶液与 1 µM 的无脂肪酸 BSA PBS 溶液混合。

使用前将混合物在室温避光孵育10分钟。接着，向每个处理过的孔中加入50 µL制备好的BODIPY脂肪酸-BSA复合物，并将培养板在37 °C孵育5分钟。用PBS配制1 µmol/L的无脂肪酸BSA溶液作为洗涤缓冲液，并预热至37 °C。

从孔中移除BODIPY脂肪酸-BSA复合物，并用50微升预热的洗涤缓冲液将整块板洗涤两次，每次洗涤1.5分钟。然后，向每孔加入50微升0.08%台盼蓝以淬灭胞外荧光。使用酶标仪立即检测胞内荧光。

从孔板中移除台盼蓝溶液后，用 PBS 轻轻洗涤细胞。向每孔加入用 10% 培养基稀释的 Hoechst 染料，终浓度为 4 微克/毫升。将孔板置于 37 摄氏度孵育 30 分钟。

然后，用 PBS 洗涤一次，以去除多余的染料。之后，向每个孔中加入新鲜的 PBS，并使用酶标仪检测 Hoechst 荧光。在 HUVEC 和 EA.hy926 细胞中，随着 BODIPY 脂肪酸浓度的升高，孵育 1 分钟、5 分钟和 10 分钟后，细胞内 BODIPY-C12 信号均显著增强。

乳酸处理一小时后，在5毫摩尔和20毫摩尔浓度下，BODIPY-C12的摄取量呈剂量依赖性增加。3-羟基异丁酸处理亦显著增强了BODIPY-C12的摄取，且在20毫摩尔浓度时摄取量最高。用1微摩尔尼可刹米处理30分钟后，与未处理的DMSO对照组相比，BODIPY-C12的摄取量显著降低。

在HUVEC细胞中与BODIPY-C16共孵育5分钟后，10毫摩尔和20毫摩尔乳酸处理均显著增加了BODIPY-C16的摄取，且呈剂量依赖性。与未处理的DMSO对照组相比，1微摩尔硝氯酚酰胺处理显著降低了BODIPY-C16的摄取。