用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

通过这种微球注射方法，我们旨在揭示毛细血管堵塞对脑皮层毛细血管网络中栓子清除潜在机制的短期和长期影响。该方法可实现对皮层毛细血管网络中荧光颗粒的实时活体成像与追踪。注射后可连续数周追踪微球及其局部效应。

我们的研究有助于理解由微血管阻塞引起的局部组织损伤。这些结果有望为新的治疗策略提供依据。现在，我们可以逐日并持续数周地研究毛细血管堵塞如何改变血管、激活细胞、改变血流以及损害血脑屏障。

首先，捏住麻醉小鼠的脚趾以确认麻醉深度。使用手术剪和解剖镊在下颌下方气管位置沿中线做一条约0.5厘米的切口。用显微缝合打结镊分离颈筋膜表层的结缔组织，暴露其下方的胸骨舌骨肌。

现在，轻轻撕开左右胸骨舌骨肌之间的结缔组织，将其分离。用组织钩将右侧肩胛舌骨肌向尾外侧牵拉。确保右侧颈动脉三角区域清晰可见，包括颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。

接下来，去除颈总动脉周围残留的筋膜和脂肪组织。仔细分离颈总动脉与迷走神经。在颈总动脉周围放置两根4/0 1.5缝线，并松松结扎，确保结扎线结不影响血流。

剥离颈内动脉和顶后动脉周围的筋膜和脂肪组织。随后使用4/0 1.5缝线结扎顶后动脉以及所有颈内动脉的分支，包括枕动脉，进行暂时性阻断。剥离颈外动脉和颞动脉周围的筋膜和脂肪组织。

使用4/0号线在颈外动脉和颞动脉上各放置两个松结。将最远端的线尽可能远离Y形分叉处放置，并用其永久结扎颈外动脉和颞动脉。 proximal knot保持不打结状态。

将10微米的微球均质并超声处理，以获得单个颗粒的均匀悬浮液。取20微升均质后的微球加入140微升FITC-葡聚糖中，得到终体积为160微升的混合液，其中含有1.44 × 10⁵个微球。短暂回抽连接于导管的注射器，以形成气锁。

然后将导管尖端浸入已配制好的 FITC-葡聚糖/Tween20/微球混合液中，缓慢回抽注射器，使混合液进入导管内。确保导管内无气泡存在。将装有混合液的导管与注射器一同放入注射泵中。

将泵速设定为每分钟10微升，并运行至导管尖端出现微球混合液的小液滴。随后，在颈内动脉上放置血管夹，并收紧先前准备好的近端结扎线之一，围绕颈总动脉进行结扎。使用显微剪刀，在结扎线远端约0.5毫米处的颈外动脉上做一个小的斜向切口，确保切口大小略小于导管直径。

用无菌纱布吸去血液。短暂启动注射泵，使微球混合物在导管尖端形成液滴，确认导管尖端无残留空气。打开颈外动脉切口，使用精细显微镊插入导管。

然后通过收紧颈外动脉周围的近端缝线，将导管固定在颈外动脉中。以每分钟10 µL的速度缓慢泵入，直至动脉明显扩张，且绿色FITC染料充满颈外动脉，以确认注射成功。接下来，移除颈内动脉上的血管夹。

然后将注射泵的流速增加至 20 微升每分钟。通过确认后顶叶动脉分叉远端的颈内动脉已被 FITC 染料填充，以验证微球注射成功。注射成功后，移除结扎颈总动脉的缝线，使微球混合物能够流入颈内动脉。

注射过程中，仍可在颈外动脉中观察到FITC染料。当导管内的混合液体达到80 µL刻度时，关闭注射泵以停止注射。随后结扎颈总动脉，夹闭颈内动脉，并轻轻取出导管，同时保留固定用的缝线。

通过拉紧固定导管的缝线，永久结扎颈外动脉。移除围绕颈总动脉、颈内动脉和顶后动脉的血管夹及缝线，以恢复血流。术后4天通过全身及全脑原位尸检成像确认微血管栓塞手术的成功。

矢状面脑切片显示微球滞留在脑组织中。术后一天成像的小鼠脑组织显示，微球主要滞留在同侧半球，位于大脑中动脉和前 cerebral 动脉的血流供应区域内。当在微球混合物中添加 Tween20 后，脑切片中的微球数量显著增加。

注射含有Tween20的微球混合物后，小鼠术后体重减轻更少，恢复更快。术后0.5小时采集的脑皮层荧光显微镜图像显示单个白色斑点，代表微球阻塞毛细血管。双光子z轴层扫投影图像显示微球引起脑微血管栓塞，并导致灌注受损。

栓塞还会导致血脑屏障破坏，表现为血管内染料明显外渗。