利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构

本实验的总体目标是量化长期暴露于HIV病毒毒素tat后皮层毛细血管网络的变化。该方法有助于检测皮层毛细血管形态的关键改变，这些改变可能与HIV相关神经认知障碍的发病机制有关。该技术的主要优势在于能够对多个毛细血管形态学参数进行符合生理学意义的精确量化。

尽管该方法可为HIV相关神经认知障碍的发病机制提供见解，但也适用于其他发生血管变化的疾病，例如阿尔茨海默病。开始此操作时，将人工泪液凝胶涂抹于麻醉小鼠的眼睛上。

接下来，使用电动剃刀剃除其头部毛发。然后，涂抹聚维酮碘溶液以消毒头皮，并等待其自然干燥。在光学显微镜下，移除动物的头皮，完全暴露顶骨、尾侧额骨以及前囟点。

在颅骨上涂抹少量10%的三氯化铁溶液，以干燥脑膜便于去除。随后用镊子轻轻刮除颅骨上的干燥脑膜。然后，在头骨窗周围涂上一层薄胶水。

轻轻将头板压在小鼠颅骨上，使感兴趣区域位于窗口中央。随后，在头板上滴加一滴牙科水泥，以使胶水聚合。接着，沿头板窗口边缘涂上一层薄胶，形成用于盛放生理盐水的储液区。

胶水干燥后，将头板拧入小鼠头板固定装置中。使用连接在微型扭矩钻上并设置为6,000 rpm的钻头，清除头板窗口上的任何胶水。每10至15秒暂停一次，以防止小鼠颅骨过热。

随后，使用新的钻头，采用设定为 4,000 rpm 的微型磨钻开始磨薄颅骨。轻轻在颅骨表面移动钻头，避免施加直接向下的压力。当颅骨被完全磨薄后，将小鼠从固定装置上取下，并使其仰卧放置。

轻轻用胶带固定两只后肢，以充分暴露内侧大腿。随后去除双侧内侧大腿的毛发，并用聚维酮碘覆盖大腿区域，对术区进行消毒。接着，轻轻剥离右侧大腿内侧、股静脉和股动脉上方的皮肤。

在手术部位滴加约三到五滴0.9%生理盐水。随后，钝性分离股神经血管束，将股静脉与股动脉分开。接着，在股动脉下方放置两段长约三厘米的外科缝线，两段缝线间距约为一厘米。

顺时针扭转上方的缝线，形成血管止血带，以帮助防止插管过程中出现大量失血。随后使用弹簧剪刀在股动脉上做一个小切口，用于后续插入导管以监测小鼠的生理参数。在该操作中，需去除小鼠左侧大腿内侧的皮肤。

接下来，定位股静脉。使用1毫升注射器和30号针头，吸取130微升荧光染料溶液。将100微升染料缓慢注入股静脉中。

拔出针头后，对注射部位施加稳定而轻柔的压力，以止住任何出血，并让染料循环5分钟。然后，用缝线闭合手术部位。小心地将小鼠翻转至俯卧位，并将其放入小鼠头部固定板装置中。

进行活体双光子成像时，将手术装置移至双光子显微镜下，并确保维持动物的麻醉水平。接着，在头板储液槽中加入少量0.9%生理盐水，并降低显微镜物镜，使其与生理盐水接触。然后，使用明场观察物镜定位目标区域。

随后，开始双光子成像。在观察屏幕上定位一个毛细血管床，并使用光学变焦放大该区域。利用双光子成像软件采集毛细血管的图像。

进行离体双光子成像时，从断头小鼠的顶间骨至额骨处沿头皮做一切口。用食指和拇指将皮肤固定于颅骨两侧，将超细剪刀置于中线顶间骨下方，沿矢状缝剪开颅骨，直至人字缝前点（bregma）后约三毫米处。随后，将颅骨与脑组织分离，并用镊子小心清除脑表面残留的脑膜。

用镊子轻轻滑入脑组织下方，将其从颅骨中分离。随后，将脑组织放入专用于小鼠的脑切片模具中，并用几滴人工脑脊液（ACSF）冲洗。接下来，切下一厚约1毫米的冠状脑片。

将脑切片放置在含有ACSF的凹形玻璃载片上，使切片最前部朝上。然后轻轻用玻璃盖片覆盖脑切片。将载片转移至显微镜载物台上，并在盖片上放置少量0.9%生理盐水。

降低显微镜物镜，直至其与生理盐水接触。随后使用明场物镜定位脑部中线。接着开始双光子成像，并使用25倍物镜再次确定中线位置。

通过在冠状切面的皮层表面寻找大脑纵裂来完成此操作。然后，将成像屏幕的右边缘置于中线上，并将观察屏幕向侧方移动三个完整的帧。在观察屏幕上毛细血管刚好可见的深度处进行定位。

然后，将焦平面再降低 20 微米以确定 z 轴堆叠的顶部。将图像厚度设置为 1 微米。将视图平面降低 100 微米，并在整个过程中调整激光功率，使超过饱和的像素少于 1%。

最后，采集z轴堆栈图像。在本图中，脑切片制备完成后，定位距中线约1.5毫米的成像区域。通过采集100微米的z轴堆栈，获得用于Amira分析软件进行三维分析的图像。

随后通过在毛细血管的起始端、终止端或任意分支点处手动放置节点，对毛细血管网络进行人工追踪。由此生成一个完整的骨架化图像，并从中自动提取形态学参数。利用双光子离体成像技术对小鼠脑切片进行成像，可提取毛细血管节点数量、节段数量、平均节段长度以及总节段长度等参数。

在此，通过活体成像生成毛细血管网络的二维图像，从中可提取毛细血管直径，并结合离体成像获得的总节段长度计算总毛细血管容积。若操作熟练，在正确执行的情况下，该过程可在3.5小时内完成。进行此操作时，重要的是在保持麻醉水平稳定的同时迅速操作，因为异氟烷可引起皮层毛细血管扩张，从而导致数据偏差。

在该实验过程中，还可获得其他毛细血管参数，例如红细胞流速或红细胞流量，这些参数有助于更深入理解与HIV相关神经认知障碍及其他神经退行性疾病中所观察到的致病性变化。祝您的实验顺利。