利用细菌蛋白质组学分析评估乳制品的微生物安全性 通过 基质辅助激光解吸电离方法

我们开发了一种从多种日常产品（如牛奶、奶油、黄油和奶酪）中制备和分离微生物群落的实验方案。一旦分离得到微生物，即可利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对其进行快速且准确的鉴定。目前仍存在的关键挑战包括培养条件的优化、数据库的局限性，以及革兰氏阳性菌和产孢菌的提取难度。首先，取具有代表性的乳制品样品，并充分混匀以确保样品均匀性。

无菌操作下，将一毫升或一克固体样品转移至含有九毫升无菌液体培养基的15毫升锥形离心管中。剧烈涡旋振荡管内混合物30至60秒，以均质化样品。随后，取一毫升均质后的悬液，依次转移至一系列各含九毫升无菌溶液的离心管中，制备十倍梯度稀释系列。

通过涡旋振荡或摇动将每种稀释液充分混匀。然后，取0.1毫升原始样品或一种已制备的稀释液，转移至含有适当琼脂培养基的已制备培养皿表面。使用无菌涂布棒，将接种物均匀涂布于琼脂平板表面。

进行有氧培养时，将制备好的样品接种至APT、M17、CBL、MPCA和TSA琼脂平板上。将平板置于37摄氏度和30摄氏度下有氧环境中培养24小时。进行厌氧培养时，将接种好的MRS琼脂平板放入厌氧培养箱中，在37摄氏度和30摄氏度下培养24至72小时。

从培养箱中取出平板，每天观察以监测微生物生长情况。使用1微升的微生物接种环，将选定的菌落划线接种到相同的琼脂培养基上进行传代培养。在与之前相同的条件下进行培养。

进行质谱分析时，首先制备MALDI基质溶液。使用50%乙腈、47.5% HPLC级水和2.5%三氯乙酸配制溶剂混合液。将基质化合物溶解于该溶剂混合液中，使其终浓度约为10毫克/毫升。

采用直接菌落转移法通过质谱鉴定细菌时，使用无菌接种环将一微升（1 µL）已培养的细菌菌落转移至 MALDI 目标板上的一个位点。将细菌样本均匀涂布，在板上形成一层薄而均匀的菌膜。待其完全干燥后，加入一微升（1 µL）HCCA 基质溶液，静置于室温下使其自然风干。

对于靶上甲酸提取法，使用一次性微生物环或无菌牙签从单个菌落中挑取少量细菌生物量。将样品直接涂布于MALDI靶板的指定位置，形成一层薄而均匀的菌膜。在涂布区域上加入1微升70%甲酸溶液。

待菌斑干燥后，覆盖1微升HCCA基质溶液，并在室温下静置使其自然干燥。对于管内蛋白质提取法，将一个至三个完整的菌落从琼脂培养平板转移至含有300微升无菌水的1.5毫升微量离心管中。加入900微升无水乙醇，使终浓度乙醇浓度约为75%。短暂混匀后，在室温下以15,000 g离心2分钟。

随后，小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后，向干燥的细胞沉淀中加入 20 至 50 微升 70% 甲酸。通过移液或涡旋混合内容物，直至沉淀完全重悬。

现在，向甲酸悬浮液中加入等体积的乙腈，并充分混匀。将离心管在15,000 g条件下离心两分钟。取1微升上清液转移至MALDI靶板上的指定位置，并使其自然干燥。

然后，用一微升 HCCA 基质溶液覆盖干燥的样品点。用移液器吸取一微升含有大肠杆菌 DH5 alpha 提取物的细菌检测标准品，或含有大肠杆菌 ATCC 25922 蛋白提取物、核糖核酸酶和肌红蛋白的微生物学校准品。为进行质谱采集和微生物鉴定，在 MALDI 目标靶板上制备校准点。

将制备好的样品点和标准品点一同加载到MALDI靶板上，并将其放入质谱仪中。在校准模式下运行校准分析以校准系统。在常规谱图采集时，质谱仪应采用线性正离子模式运行。

然后，将质谱仪的质量检测范围设置为覆盖 2,000 至 20,000 的质荷比。每个点采集两份光谱，以确保每个样本至少获得四次技术重复。现在，采用 Savitzky-Golay 方法作为平滑算法。

使用 TopHat 算法进行基线校正以去除背景噪声。然后，采用质心模式检测峰。将未知细菌分离株的处理后质谱数据上传至 MALDI 软件中的微生物鉴定平台，并运行鉴定程序。

根据制造商设定的阈值标准评估鉴定得分。质谱图显示了物种特异性的蛋白质谱型，从而实现了属或种水平的鉴定。树状图揭示了同一种内菌株之间具有高度相似性，而不同种之间则表现出明显区分。

对于地衣芽孢杆菌，12小时的较短培养时间产生了较高的鉴定得分值2.38，而18至24小时的较长培养时间由于孢子信号占主导，导致鉴定得分值降低至1.85。在样本制备方法中，管内蛋白质提取法获得最高的鉴定得分值2.23，其次是靶上甲酸提取法，得分为1.97，直接菌落转移法得分最低，为1.61。通过将培养组学与定制化的样本制备方法相结合，基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术能够以更低的成本实现更精确、更快速的微生物组分析，其结果可与参考的16S rRNA方法相媲美。

本方案可实现对乳制品中微生物的常规高通量监测，提高检测速度与准确性，从而加强食品安全与质量保障体系。在工业实验室中扩展基质辅助激光解吸电离（MALDI）数据库并实现工作流程自动化，将有助于提升微生物鉴定能力，增加检测通量，减少错误，并加快微生物群监测速度。